CRISPR/Cpf1技术编辑二倍体马铃薯基因组的研究

发布时间：2020-12-12 05:46

　　在植物的基因组进行定点编辑对农作物的遗传改良具有重要意义。目前,CRISPR/Cas9系统因其简便性和高效性已被广泛应用于包含马铃薯在内的多种作物的基因组编辑。然而,由于CRISPR/Cas9系统仅能识别PAM序列为5’-NGG-3’的前导序列,极大限制了其定点编辑的适用范围,因此如何扩展CRISPR系统的编辑范围是目前基因编辑领域一个重要的研究方向。CRISPR/Cpf1是一类新型CRISPR系统,其可特异识别PAM序列为5’-TTTN-3’后面的24 bp,这极大丰富了CRISPR系统对靶标位点的选择范围,因而其也成为继CRISPR/Cas9系统后又一研究热点。然而CRISPR/Cpf1系统在茄科作物中的研究还不是很深入,在马铃薯中的应用就未见报道,因此本论文拟针对CRISPR/Cpf1系统在马铃薯中的应用进行系统的研究。首先,本论文根据前人的研究基础,分别对Cpf1蛋白的两个变体LbCpf1和AsCpf1进行了基于双子叶植物的密码子优化,然后针对CrRNA的表达系统,构建了4套优化表达体系:核酸酶介导的RIBO系统,基于Cys4的CrRNA切除的Csy4系统,多顺反子RNA表达的... 

【文章来源】：云南师范大学云南省

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

a图为AsCpf1的晶体结构图

图 2.2 CIP-65 材料基因组的全长以及靶点示意图在靶点的一个 5'端添加上 ATTG,在其反向互补的 5'端加上 AAAC。B位点合成引物，2 个靶点的设计了 4 条 sgRNA 的引物：StCDF1 sp1-F：ATTGGATTCATGATCCAAATGAAGStCDF1 sp1-R：AAACCTTCATTTGGATCATGAATCStCDF1 sp2-F：AGCGATGACATCAAGATGCStCDF1 sp2-R: GCATCTTGATGTCATCGCT将两个引物做退火体系如表(2.3)sgRNA引物退火体系表 2.3成分 加入量tCDF1 sp1/sp2-F (100 μM） 3μLStCDF1 sp1/sp2-R (100 μM) 3μL10xNEB buffer3.1 10μL超纯水 88 μLtotal 100 μL

第二章 载体的设计与构建酶切连接体系放在 PCR 仪中：37℃条件下 10 h；50℃条件下 5 m 10 min。取 10 μL 连接产物对大肠杆菌进行转化后，经过菌筛后StCDF1/PKSE402 -SP1 载体与 StCDF1/PKSE402 –SP2。2.3 CRISPR/AS-Cpf1 与 CRISPR/LB-Cpf1 的载体组装 CPF1 蛋白与其他载体元件大片段的合成 们 将 Acidaminococcus sp. BV3L6Cpf1(AsCpf1) 与 Lachnosum ND2006(LbCpf1)的 Cpf1 序列做了植物性密码子优化，并在公的合成：示意图如下：2.3 与 2.4


本文编号：2911965