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基于CRISPR/Cas12a的食气扬氏梭菌基因组编辑工具的建立与应用

发布时间:2020-12-25 12:38
  大部分细菌和几乎所有古生菌的基因组中,都存在着一种规律排列成簇的短回文重复序列CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats),由 spacer和repeat间隔排列组成。这种重复序列的相邻位置往往是一些CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins)Cas的编码基因,这类蛋白具有核糖核酸内切酶的功能,与CRISPR转录出的导向性RNA共同形成这些微生物中的一种适应性免疫系统,即CRISPR-Cas系统,用于抵御外来病毒和噬菌体的入侵。基于该系统的特性,人们发展了一系列高效的基因编辑工具,在植物、动物、微生物中均得到广泛应用。Cas12a(又称Cpf1)属于Cas蛋白家族的ClassII typeV型蛋白,含有Ruvc结构域和Nuc结构域,同时具备DNA核酸酶活性和RNA核酸酶活性。与常用的Cas9不同的是,Cas12a不仅可以对靶标DNA进行切割,也可以对自身CRISPR转录的RNA前体进行切割加工,形成成熟的crRNA(CRISPRRNA)。而且Cas12a蛋白的分子量比C... 

【文章来源】:河南大学河南省

【文章页数】:72 页

【学位级别】:硕士

【部分图文】:

基于CRISPR/Cas12a的食气扬氏梭菌基因组编辑工具的建立与应用


图2-1.四种不同来源的Casl2a蛋白对扬氏梭菌的体内毒性测试??注:对照为不携带Casl2a蛋白的质粒;Fn:新凶手弗朗西斯菌議:加//^/?subsp.?/7〇v/c油??

启动子,质粒,拟杆菌,凶手


?1??Control?Fn?Bb?Hk?Ts??图2-1.四种不同来源的Casl2a蛋白对扬氏梭菌的体内毒性测试??注:对照为不携带Casl2a蛋白的质粒;Fn:新凶手弗朗西斯菌議:加//^/?subsp.?/7〇v/c油??U112);??Bb:拟杆菌(召沉妙KA00251)?;?Hk:创伤球菌femz"?ATCC?51366);??Ts:硫微螺菌(77?/讀/ra?sp.?XS5)??Figure?2-1.?In?vivo?toxicity?test?of?four?different?sources?of?Casl2a?protein?against?Clostridium??ljungdahlii.?The?control?is?a?plasmid?that?does?not?carry?the?Casl2a?protein;??Fn:?Francisella?novicida?subsp.?novicida?U112;?Bb:?Bacteroidales?bacterium?KA00251;?Hk:??Helcococcus?kunzii?ATCC?51366);?Ts:?Thiomicrospira?sp.?XS5??7000?n?□?Control?H?P02440?DParaE??…^?IHP09110?C]P41670?CIP39340?_??6000?'?-P01440??ra?5000?-?15。]??3?4000?-?100??f?3000?-50'?■?I?^?rl??1?2000?产?1??i〇〇〇?-?r?■??〇?J?r-n?■?

效率测试,双链,复合物,梭菌


pZGFncas?12a-ptaO?I?(构建方法见本章材料与方法)。质粒通过电转化导入扬氏梭菌感受??态细胞。结果表明,导入这两个质粒的扬氏梭菌在平板培养基上均没有产生任何转化子,??而对照质粒的转化子数量较多(图2-3)。这就暗示F?Cas12a蛋白在扬氏梭菌中具有较??高的切割双链DNA的活性,可以作为建立基因编辑工具的功能蛋白。??P01440?Pthl??—^F^Cas12a^^^?crRNAS-??360?1????5?300?:??¥?240?;??兰180?;??ZL??g120;??°?60?:??0??I?i?1???#?>?^??c/?4?c/??图2-3.?F/CasPa-crKNA复合物的构建及其在C../WA7职W;///中切割双链DNA的效率测试。??注:靶标基因?CUU_c35680,?靶标基因?CLRJ_cl2770。Control:携带?F?Casl2a?但不含??crRNA的质粒。??Figure?2-3.?Construct?of?the?r^CaslZa-crRNA?cassette?and?its?cleavage?efficiency?ofdouble??strand?DNA?in?C.?Ijimgdahlii.?The?targets?chosen?for?test?are?thepyrE?and?pta?gene.?Control:??the?plasmid?carrying?F?Casl2a?but?no?crRNA.??2.3.3构建CFUSPR-Casl2a基因敲除质粒??基于上述结果

【参考文献】:
期刊论文
[1]新一代基因组编辑系统CRISPR/Cpf1[J]. 杨帆,李寅.  生物工程学报. 2017(03)



本文编号:2937670

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