蓝细菌糖原代谢动态调控和生理功能研究
发布时间：2021-02-03 23:33
作为光合自养型原核生物,蓝细菌能够利用光合作用固定二氧化碳并将其作为碳源用于合成有机化合物。来自光合作用的大量碳源和能量除了用于细胞生长和代谢活动外,很大一部分将以糖原的形式作为蓝细菌天然碳汇物质而存在。而以蓝细菌为底盘构建的光驱固碳细胞工厂为了提高目标化合物的产量,需要将蓝细菌中的碳源更多地重定向至目标化合物的合成途径,以此为目标,糖原合成途径的改造和调控成为蓝细菌代谢工程的重要选择。调节控制蓝细菌的糖原合成、实现碳流的重定向成为优化细胞工厂效率的主要策略。本研究以常用于光合细胞工厂开发的蓝细菌模式藻株聚球藻PCC7942为出发藻株,以其糖原合成途径的关键限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（GlgC）为改造靶点,利用茶碱响应型核糖开关对glgC的表达、糖原的合成进行调控,并进一步探索糖原合成量改变是否会引起细胞生理功能的变化。通过核糖开关调控的方法,能够对聚球藻PCC7942的糖原合成量实现上下调控:减少糖原合成量时,聚球藻PCC7942细胞在正常条件下的生理功能和生长状态并没有受到损害,但细胞耐受性在面临环境胁迫时明显降低,无法维持正常生长;当糖原合成量通过改变茶碱浓度诱导增加时,聚球...
【文章来源】：中南林业科技大学湖南省
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２．１茶碱响应核糖开关工作原理示意图（Ａ）和核苷酸序列（Ｂ）?［９４］??．ｍｍｎ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ?ｇｅｎｅ；?ＰｇｌｇＣ，?ｎａｔｉｖｅ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｏｆ?ｇｌｇＣ??转化聚球藻ＰＣＣ７９４２后，涂布卡那霉素抗性平板获得的转化子的??ＰＣＲ鉴定结果如图２．３所示，无插入片段的野生型条带大小为２．２ｋｂ，包??含了插入片段的转化子具有的条带大小为４．２ｋｂ。并且，在转化子条带中??看不到野生型条带，证明整合完全，说明在聚球藻ＰＣＣ７９４２中成功于??ｇ／ｇＣ基因上游插入茶碱响应核糖开关。我们将转化藻株命名为聚球藻??ＳｙｗｅｃＺ／ｏｃｏｃｃｗｓ?ＰＣＣ７９４２－ＸＣ１，下文简称?ＸＣ１。??ＸＣ１?ＷＴ??５ｋ－？—＊??４ｋ－一??３ｋ－￣＊????ｍｍ??２?ｋ—??图２．３工程藻株ＸＣｌ和对照藻株ＷＴ７９４２的基因型鉴定??Ｆｉｇｕｒｅ?２．３?Ｇｅｎｏｔｙｐｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＰＣＣ７９４２－ＸＣ１?ａｎｄ?ＰＣＣ７９４２－ＷＴ?ｂｙ?ＰＣＲ．??２７??
验证在工程藻株ＸＣ１中茶碱响应核糖开关的可行性，我们选择蛋白免疫??印迹（ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ）对转化藻株进行检测。??蓝细菌蛋白提取后的浓度测定所采用标准曲线如图２．４所示，并根??据待测样品的最低浓度，将所有样品的蛋白浓度调整为一致，保证后续??蛋白免疫印迹实验上样时具有相同的蛋白总量。??蛋白免疫印迹结果如图２．５所示：通过蛋白免疫印迹结果可以看出，??对照藻株ＷＴ７９４２的ＧｌｇＣ蛋白丰度在不同茶碱浓度下所产生的区别较??小，茶碱浓度的递增对ＧｌｇＣ蛋白的表达量没有太大影响。而茶碱响应核??糖开关调控ｇ／ｇＣ基因的工程藻株ＸＣ１在不同茶碱浓度下的ＧｌｇＣ蛋白??表达量具有较大差异：在无茶碱诱导（ＴＯ）时，蛋白丰度上要远远低于??ＷＴ７９４２；随着茶碱浓度增加至ｌｌＯｐＭ?（Ｔ１１０）时，ＧｌｇＣ蛋白丰度出现??了明显的提高，在茶碱浓度提高为ｌｌＯＯｐＭ?（Ｔ１１００）时，ＧｌｇＣ蛋白丰度??则明显高于ＷＴ７９４２。这说明茶碱对于ＷＴ７９４２藻株的影响较小，同时??插入茶碱响应核糖开关的工程藻株ＸＣ１通过外源茶碱浓度的改变成功??实现了在翻译水平上对ＧｌｇＣ蛋白的诱导调控。??０．８????ｙ?＝?１．７４２９Ｘ?＋?０．０２９８??０７?－?ＲＪ?＝?０．９９２５??０．６?－??的?〇．５?－??ｑ＞?？？？？??０．
【参考文献】：
期刊论文
[1]Sucrose Secreted by the Engineered Cyanobacterium and Its Fermentability[J]. DUAN Yangkai,LUO Quan,LIANG Feiyan,LU Xuefeng. Journal of Ocean University of China. 2016(05)
本文编号：3017340
【文章来源】：中南林业科技大学湖南省
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２．１茶碱响应核糖开关工作原理示意图（Ａ）和核苷酸序列（Ｂ）?［９４］??．ｍｍｎ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ?ｇｅｎｅ；?ＰｇｌｇＣ，?ｎａｔｉｖｅ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｏｆ?ｇｌｇＣ??转化聚球藻ＰＣＣ７９４２后，涂布卡那霉素抗性平板获得的转化子的??ＰＣＲ鉴定结果如图２．３所示，无插入片段的野生型条带大小为２．２ｋｂ，包??含了插入片段的转化子具有的条带大小为４．２ｋｂ。并且，在转化子条带中??看不到野生型条带，证明整合完全，说明在聚球藻ＰＣＣ７９４２中成功于??ｇ／ｇＣ基因上游插入茶碱响应核糖开关。我们将转化藻株命名为聚球藻??ＳｙｗｅｃＺ／ｏｃｏｃｃｗｓ?ＰＣＣ７９４２－ＸＣ１，下文简称?ＸＣ１。??ＸＣ１?ＷＴ??５ｋ－？—＊??４ｋ－一??３ｋ－￣＊????ｍｍ??２?ｋ—??图２．３工程藻株ＸＣｌ和对照藻株ＷＴ７９４２的基因型鉴定??Ｆｉｇｕｒｅ?２．３?Ｇｅｎｏｔｙｐｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＰＣＣ７９４２－ＸＣ１?ａｎｄ?ＰＣＣ７９４２－ＷＴ?ｂｙ?ＰＣＲ．??２７??
验证在工程藻株ＸＣ１中茶碱响应核糖开关的可行性，我们选择蛋白免疫??印迹（ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ）对转化藻株进行检测。??蓝细菌蛋白提取后的浓度测定所采用标准曲线如图２．４所示，并根??据待测样品的最低浓度，将所有样品的蛋白浓度调整为一致，保证后续??蛋白免疫印迹实验上样时具有相同的蛋白总量。??蛋白免疫印迹结果如图２．５所示：通过蛋白免疫印迹结果可以看出，??对照藻株ＷＴ７９４２的ＧｌｇＣ蛋白丰度在不同茶碱浓度下所产生的区别较??小，茶碱浓度的递增对ＧｌｇＣ蛋白的表达量没有太大影响。而茶碱响应核??糖开关调控ｇ／ｇＣ基因的工程藻株ＸＣ１在不同茶碱浓度下的ＧｌｇＣ蛋白??表达量具有较大差异：在无茶碱诱导（ＴＯ）时，蛋白丰度上要远远低于??ＷＴ７９４２；随着茶碱浓度增加至ｌｌＯｐＭ?（Ｔ１１０）时，ＧｌｇＣ蛋白丰度出现??了明显的提高，在茶碱浓度提高为ｌｌＯＯｐＭ?（Ｔ１１００）时，ＧｌｇＣ蛋白丰度??则明显高于ＷＴ７９４２。这说明茶碱对于ＷＴ７９４２藻株的影响较小，同时??插入茶碱响应核糖开关的工程藻株ＸＣ１通过外源茶碱浓度的改变成功??实现了在翻译水平上对ＧｌｇＣ蛋白的诱导调控。??０．８????ｙ?＝?１．７４２９Ｘ?＋?０．０２９８??０７?－?ＲＪ?＝?０．９９２５??０．６?－??的?〇．５?－??ｑ＞?？？？？??０．
【参考文献】：
期刊论文
[1]Sucrose Secreted by the Engineered Cyanobacterium and Its Fermentability[J]. DUAN Yangkai,LUO Quan,LIANG Feiyan,LU Xuefeng. Journal of Ocean University of China. 2016(05)
本文编号：3017340
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3017340.html
教材专著
