一种假单胞菌来源的支链氨基酸氨基转移酶的酶学性质研究及晶体结构解析
发布时间：2021-02-11 13:23
氨基转移酶（AT）由于能够将氨基转移到酮或酮酸中,并且具有高对映选择性和区域选择性,是用于合成手性氨基酸或者酮酸的重要生物催化剂。在所有的转氨酶中,支链氨基酸氨基转移酶（BCAT）能可逆地催化支链氨基酸（BCAAs）,如L-缬氨酸,L-亮氨酸和L-异亮氨酸,与α-酮戊二酸生成相应的酮酸和L-谷氨酸。目前,BCAT已应用于包括L-叔亮氨酸在内的非天然氨基酸及支链酮酸的生物合成。尽管BCAT具有巨大的潜力,但绝大多数的酶仍然缺乏广泛的底物范围和活性,因此研究新来源和新型酶具有很大的前景。本论文中,我们通过生物信息学的手段挖掘出4种不同来源的BCAT,并在大肠杆菌中进行了克隆、表达及纯化。在进行了活性对比后,选择了来源于假单胞菌来源的BCAT（PsBCAT）,进一步对其酶学性质和晶体结构进行了分析研究。酶学性质研究结果表明,PsBCAT的最适反应pH、温度及PLP浓度分别为8.5、40oC、10 mM。PsBCAT表现出相对较宽的底物谱,并且对L-亮氨酸,L-缬氨酸,L-异亮氨酸和L-苯丙氨酸具有显著高的活性,活性分别为105 U/mg,127 U/mg,115 U/mg和98 U/mg。另...
【文章来源】：新疆大学新疆维吾尔自治区 211工程院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
缩略词
摘要
Abstract
第一章 引言
1.1 酮酸
1.1.1 酮酸概述
1.1.2 酮酸的应用
1.1.3 酮酸的合成
1.2 手性氨基酸
1.2.1 手性氨基酸概述及应用
1.2.2 手性氨基酸的合成
1.2.3 L-叔亮氨酸
1.3 转氨酶
1.3.1 转氨酶概述
1.3.2 支链氨基酸氨基转移酶
1.4 蛋白质晶体学
1.4.1 蛋白质结晶原理
1.4.2 蛋白质结晶方法
1.5 选题依据
1.6 研究内容
1.7 创新点
1.8 技术路线
第二章 生物信息学及BCATs的克隆、表达与纯化
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 实验材料
2.2.2 实验方法
2.3 实验结果
2.3.1 BACT序列的网络分析和高活性、新底物选择性BCAT挖掘
2.3.2 重组蛋白的表达纯化
2.4 小结
第三章 PsBCAT的酶学性质研究
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 实验材料
3.2.2 实验方法
3.3 实验结果
3.3.1 最适反应pH的测定
3.3.2 最适反应温度的测定
3.3.3 PLP浓度对酶活性影响的测定
3.3.4 底物特异性的测定
3.3.5 动力学测定
3.4 小结
第四章 PsBCAT晶体结构解析
4.1 前言
4.2 实验材料与方法
4.2.1 实验材料
4.2.2 实验方法
4.3 结果
4.3.1 蛋白质结晶条件初筛结果
4.3.2 蛋白质结晶条件优化结果
4.3.3 晶体的整体结构分析
4.3.4 活性位点分析
4.4 小结
第五章 合成L-叔亮氨酸
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.2.1 实验材料
5.2.2 实验方法
5.3 结果
5.3.1 BsOrnAT的克隆、表达及纯化
5.3.2 PsBCAT催化合成合成L-叔亮氨酸
5.3.3 偶联生物系统催化合成L-叔亮氨酸
5.4 小结
总结与展望
总结
展望
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]蛋白质晶体学技术的发展与展望[J]. 李兰芬,南洁,苏晓东. 生物物理学报. 2007(04)
[2]柱前衍生化-HPLC测定田参氨基酸胶囊中10种氨基酸的含量[J]. 钱广生,苏旭,刘三康,李章万. 华西药学杂志. 2005(02)
博士论文
[1]PHA颗粒结合蛋白的表达、结晶与X射线衍射分析[D]. 赵明莲.清华大学 2005
硕士论文
[1]人线粒体天冬氨酸转氨酶结晶及晶体结构研究[D]. 王佳.大连理工大学 2016
[2]重组制备人细胞质谷草转氨酶及结晶条件研究[D]. 常海洋.大连理工大学 2016
本文编号：3029177
【文章来源】：新疆大学新疆维吾尔自治区 211工程院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
缩略词
摘要
Abstract
第一章 引言
1.1 酮酸
1.1.1 酮酸概述
1.1.2 酮酸的应用
1.1.3 酮酸的合成
1.2 手性氨基酸
1.2.1 手性氨基酸概述及应用
1.2.2 手性氨基酸的合成
1.2.3 L-叔亮氨酸
1.3 转氨酶
1.3.1 转氨酶概述
1.3.2 支链氨基酸氨基转移酶
1.4 蛋白质晶体学
1.4.1 蛋白质结晶原理
1.4.2 蛋白质结晶方法
1.5 选题依据
1.6 研究内容
1.7 创新点
1.8 技术路线
第二章 生物信息学及BCATs的克隆、表达与纯化
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 实验材料
2.2.2 实验方法
2.3 实验结果
2.3.1 BACT序列的网络分析和高活性、新底物选择性BCAT挖掘
2.3.2 重组蛋白的表达纯化
2.4 小结
第三章 PsBCAT的酶学性质研究
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 实验材料
3.2.2 实验方法
3.3 实验结果
3.3.1 最适反应pH的测定
3.3.2 最适反应温度的测定
3.3.3 PLP浓度对酶活性影响的测定
3.3.4 底物特异性的测定
3.3.5 动力学测定
3.4 小结
第四章 PsBCAT晶体结构解析
4.1 前言
4.2 实验材料与方法
4.2.1 实验材料
4.2.2 实验方法
4.3 结果
4.3.1 蛋白质结晶条件初筛结果
4.3.2 蛋白质结晶条件优化结果
4.3.3 晶体的整体结构分析
4.3.4 活性位点分析
4.4 小结
第五章 合成L-叔亮氨酸
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.2.1 实验材料
5.2.2 实验方法
5.3 结果
5.3.1 BsOrnAT的克隆、表达及纯化
5.3.2 PsBCAT催化合成合成L-叔亮氨酸
5.3.3 偶联生物系统催化合成L-叔亮氨酸
5.4 小结
总结与展望
总结
展望
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]蛋白质晶体学技术的发展与展望[J]. 李兰芬,南洁,苏晓东. 生物物理学报. 2007(04)
[2]柱前衍生化-HPLC测定田参氨基酸胶囊中10种氨基酸的含量[J]. 钱广生,苏旭,刘三康,李章万. 华西药学杂志. 2005(02)
博士论文
[1]PHA颗粒结合蛋白的表达、结晶与X射线衍射分析[D]. 赵明莲.清华大学 2005
硕士论文
[1]人线粒体天冬氨酸转氨酶结晶及晶体结构研究[D]. 王佳.大连理工大学 2016
[2]重组制备人细胞质谷草转氨酶及结晶条件研究[D]. 常海洋.大连理工大学 2016
本文编号：3029177
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3029177.html
教材专著
