Ⅰ型启动子及其终止序列对植物病毒载体系统表达效率的影响分析
发布时间：2021-02-15 10:03
植物RNA病毒载体表达系统是一种有潜力的外源基因瞬时表达平台,生物安全性是阻碍其应用的瓶颈问题之一。Ⅰ型启动子具有的种属间特异性,理论上可以缩小重组病毒的宿主范围降低病毒载体潜在的生物危害性。Ⅰ型启动子已被广泛应用于动物病毒载体的研究中,但在植物中却鲜有报道。植物Ⅰ型启动子能否像哺乳动物Ⅰ型启动子一样,高效地提高病毒载体的生物安全性仍有待验证。鉴于此,本论文以番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus,TBSV）为实验材料,构建本氏烟Ⅰ型启动子介导转录的TBSV病毒表达载体,通过分析接种叶片中重组GFP表达情况,探索本氏烟Ⅰ型启动子顺式调控序列、转录特性和Ⅰ型终止子对病毒载体的影响,初步明确Ⅰ型启动子介导转录的植物病毒载体表达系统的有效性和主要特征。研究发现,①本氏烟Ⅰ型启动子长度对启动子转录频率和病毒载体的表达水平无显著影响;长度仅为77 nt的启动子就可以起始病毒基因组RNA的转录;并且其启动子结构中不存在类似于动物Ⅰ型启动子的上游控制元件（Upstream control element,UCE）;②启动子转录起始位点上游T串序列以及转录起始位点核苷酸A/G互...
【文章来源】：宁夏大学宁夏回族自治区 211工程院校
【文章页数】：48 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
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在接种后第４天提取每个处理样品的总ＲＷＡ，并通过体外反转录获得相应的ｃＤＮＡ。以含有??内含子和无内含子的质粒为对照进行ＰＣＲ反应和琼脂糖凝胶电泳检测，在核酸水平上分析内含??子序列在烟草植物细胞核内的加工过程。检测引物位置及检测的内含子位置如图３－８Ａ所示。从??检测结果来看（图３－８Ｂ）?，?４种载体的扩增条带与无内含子质粒对照ＰＣＲ扩增产物条带大小一??致，而内含子质粒对照样品ＰＣＲ产物扩增条带略大。由于４种病毒表达载体的转录产物中均为??未检测到内含子序列，推测１型启动子内含子载体的转录产物能够被宿主细胞内含子加工机器识??别并加工。由于１型和Ｕ型启动子都具有ＴＡＴＡ框，推测受体植物细胞中的Ｐｏｌ?１１识别了?１型启??动子并发生了低水平转录，植物ｉ型启动子具有转录的非专一性特点。??Ａ．??５’?ＵＴＲ?ｐ３３?ｐ９２??＾?ＩＩ?ＩＩ?ＩＩ?Ｉ?ＩＩ?ＩＩ?ＩＩ?ＩＩ?ＩＩ?１１?１??—？?－４—??Ｉ??ｔ?５?１??．Ｉ?１?％??ｉ?ｒｉ?＾?％?％??Ｂ．?ｃ?＾１２?｜｜??ｅ?＝窆?Ｉ?｜?｜??Ｍ?￡?￡?Ｓ?Ｓ?￡?ｉ??２０００—?Ｉ??图３－８病毒载体中内含子在寄主细胞核中的加工情况分析（４?ｄｐｉ）??Ａ．?ｐ３３和ｐ９２编码区中内含子位置示意图及其ＲＴ－ＰＣＲ检测引物位置示意图；箭头显示引物对位置和方向：??Ｂ．?ＲＴ－ＰＣＲ检测ｐ３３和ｐ９２编码区中内含子在寄主细胞中的加工情况??３．２．２?ＥＬＳ和转录起始位点下游序列对Ｉ型启动子转录专一性影响??为了探究植物１型启动子转录的非专一性是由于下游延仲序列和ＥＬＳ序列的修改造成的
【参考文献】：
期刊论文
[1]真核启动子研究进展[J]. 汤方,涂慧珍. 林业科技开发. 2015(02)
[2]组织特异性启动子在作物基因工程中的研究进展[J]. 贺红霞,陈亮,林春晶,柳青. 中国农学通报. 2014(09)
[3]植物生物反应器生产药用蛋白[J]. 权美平,任秀娟. 氨基酸和生物资源. 2012(04)
[4]基于高通量测序454 GS FLX的丹参转录组学研究[J]. 李滢,孙超,罗红梅,李西文,牛云云,陈士林. 药学学报. 2010(04)
[5]农杆菌渗入法介导的基因瞬时表达技术及应用[J]. 邱礽,陶刚,李奇科,邱又彬,刘作易. 分子植物育种. 2009(05)
[6]植物生物反应器的研究进展[J]. 杨晶,李天航,熊丽东,庞实峰,李校堃. 生物工程学报. 2009(05)
[7]植物病毒表达载体的研究现状及其应用前景[J]. 田秀艳,王振东. 安徽农业科学. 2009(01)
[8]应用反向遗传学技术在哺乳动物细胞中产生甲型流感病毒[J]. 陈稚峰,张立国,董婕,吴昆昱,陈爱珺,孙梅生,黄银霞,齐立,张智清,郭元吉. 病毒学报. 2002(03)
[9]植物RNA病毒载体构建策略[J]. 邓晓东,费小雯,刘志昕,郑学勤. 生命科学研究. 1999(01)
[10]高等植物启动子研究进展[J]. 李一琨,王金发. 植物学通报. 1998(S1)
博士论文
[1]水稻组织特异型合成启动子的构建、双向启动子的鉴定及OsPGIP1在抗纹枯病中的功能研究[D]. 王睿.华中农业大学 2016
硕士论文
[1]基于TBSV的植物RNA病毒表达载体的优化[D]. 张西倩.宁夏大学 2017
[2]农杆菌介导的瞬时表达系统在烟草、丹参、夏枯草中的建立[D]. 梁童瑶.西北农林科技大学 2015
本文编号：3034638
【文章来源】：宁夏大学宁夏回族自治区 211工程院校
【文章页数】：48 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图３－５内含子病毒表达载体的结构??ＲＢ：Ｉ－ＤＮＡ右边界：Ｐｏｌｌｌ－３５Ｓ：花揶菜花叶病毒３５Ｓ启动子：ｐ３３，ｐ９２，ｐｌ９和ｐ２２：?ＩＢＳＶ病毒基因组编码区，??
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在接种后第４天提取每个处理样品的总ＲＷＡ，并通过体外反转录获得相应的ｃＤＮＡ。以含有??内含子和无内含子的质粒为对照进行ＰＣＲ反应和琼脂糖凝胶电泳检测，在核酸水平上分析内含??子序列在烟草植物细胞核内的加工过程。检测引物位置及检测的内含子位置如图３－８Ａ所示。从??检测结果来看（图３－８Ｂ）?，?４种载体的扩增条带与无内含子质粒对照ＰＣＲ扩增产物条带大小一??致，而内含子质粒对照样品ＰＣＲ产物扩增条带略大。由于４种病毒表达载体的转录产物中均为??未检测到内含子序列，推测１型启动子内含子载体的转录产物能够被宿主细胞内含子加工机器识??别并加工。由于１型和Ｕ型启动子都具有ＴＡＴＡ框，推测受体植物细胞中的Ｐｏｌ?１１识别了?１型启??动子并发生了低水平转录，植物ｉ型启动子具有转录的非专一性特点。??Ａ．??５’?ＵＴＲ?ｐ３３?ｐ９２??＾?ＩＩ?ＩＩ?ＩＩ?Ｉ?ＩＩ?ＩＩ?ＩＩ?ＩＩ?ＩＩ?１１?１??—？?－４—??Ｉ??ｔ?５?１??．Ｉ?１?％??ｉ?ｒｉ?＾?％?％??Ｂ．?ｃ?＾１２?｜｜??ｅ?＝窆?Ｉ?｜?｜??Ｍ?￡?￡?Ｓ?Ｓ?￡?ｉ??２０００—?Ｉ??图３－８病毒载体中内含子在寄主细胞核中的加工情况分析（４?ｄｐｉ）??Ａ．?ｐ３３和ｐ９２编码区中内含子位置示意图及其ＲＴ－ＰＣＲ检测引物位置示意图；箭头显示引物对位置和方向：??Ｂ．?ＲＴ－ＰＣＲ检测ｐ３３和ｐ９２编码区中内含子在寄主细胞中的加工情况??３．２．２?ＥＬＳ和转录起始位点下游序列对Ｉ型启动子转录专一性影响??为了探究植物１型启动子转录的非专一性是由于下游延仲序列和ＥＬＳ序列的修改造成的
【参考文献】：
期刊论文
[1]真核启动子研究进展[J]. 汤方,涂慧珍. 林业科技开发. 2015(02)
[2]组织特异性启动子在作物基因工程中的研究进展[J]. 贺红霞,陈亮,林春晶,柳青. 中国农学通报. 2014(09)
[3]植物生物反应器生产药用蛋白[J]. 权美平,任秀娟. 氨基酸和生物资源. 2012(04)
[4]基于高通量测序454 GS FLX的丹参转录组学研究[J]. 李滢,孙超,罗红梅,李西文,牛云云,陈士林. 药学学报. 2010(04)
[5]农杆菌渗入法介导的基因瞬时表达技术及应用[J]. 邱礽,陶刚,李奇科,邱又彬,刘作易. 分子植物育种. 2009(05)
[6]植物生物反应器的研究进展[J]. 杨晶,李天航,熊丽东,庞实峰,李校堃. 生物工程学报. 2009(05)
[7]植物病毒表达载体的研究现状及其应用前景[J]. 田秀艳,王振东. 安徽农业科学. 2009(01)
[8]应用反向遗传学技术在哺乳动物细胞中产生甲型流感病毒[J]. 陈稚峰,张立国,董婕,吴昆昱,陈爱珺,孙梅生,黄银霞,齐立,张智清,郭元吉. 病毒学报. 2002(03)
[9]植物RNA病毒载体构建策略[J]. 邓晓东,费小雯,刘志昕,郑学勤. 生命科学研究. 1999(01)
[10]高等植物启动子研究进展[J]. 李一琨,王金发. 植物学通报. 1998(S1)
博士论文
[1]水稻组织特异型合成启动子的构建、双向启动子的鉴定及OsPGIP1在抗纹枯病中的功能研究[D]. 王睿.华中农业大学 2016
硕士论文
[1]基于TBSV的植物RNA病毒表达载体的优化[D]. 张西倩.宁夏大学 2017
[2]农杆菌介导的瞬时表达系统在烟草、丹参、夏枯草中的建立[D]. 梁童瑶.西北农林科技大学 2015
本文编号：3034638
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