假单胞菌脂肪酶的表达及调控机制研究
发布时间：2021-02-20 23:13
脂肪酶是一种重要的工业用酶,广泛应用于化学品、食品、药品、洗涤剂、纺织、皮革、新型材料、乳制品、化妆品、造纸、污染处理和生物能源等工业领域中。在这些脂肪酶中,细菌脂肪酶较其它来源的脂肪酶在水相、有机相中催化的反应类型更多、反应活性及稳定性更高,其中又以假单胞菌属（Pseudomonas）脂肪酶的性能最为优越。虽然细菌脂肪酶具有诸多优点,但其产量普遍较低,常规育种方法难以满足工业化生产的大量需求,因此市场价格昂贵、供不应求。综合文献分析,可采用两种策略提高细菌脂肪酶的表达,即针对不依赖折叠酶或者较少依赖折叠酶的细菌脂肪酶基因（如:荧光假单胞菌脂肪酶基因）,采用异源表达的途径提高脂肪酶的产量;对于对折叠酶有较强依赖性的细菌脂肪酶（如:铜绿假单胞菌脂肪酶）,则通过研究其基因表达调控机制来提高脂肪酶的表达量。为此,本论文以假单胞菌属脂肪酶为研究对象,对上述两个方面均做了有益探索,主要研究内容和结果摘要如下:1.在异源表达路径中,本研究以荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）Pf0-1的预测脂肪酶基因Pflip1为研究对象,分别将其在大肠杆菌和毕赤酵母中异源表达,获得对应...
【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：160 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
经典的α/β水解酶折叠子[1]
华中科技大学博士学位论文4理化性质的深入研究中发现，脂肪酶具有独特的化学选择性、位置选择性和立体选择性，不要求辅助因子，且可以在微生物中高效表达[2]。因此，它们具有极大的工业应用价值，广泛应用于农业化学品、药品、洗涤剂、食品和乳制品中[32,33]。图1.2脂肪酶的催化机制[1]Fig.1.2Thecatalyticmechanismoflipase[1]1.3.1脂肪酶在清洁剂工业的应用脂肪酶商业化应用需求较大的一个领域就是它作为洗涤剂的添加物，居民家庭清洁和工业部门的洗涤需求对于这类酶有极大的需求[34]。为了提高脂肪酶在洗涤工业的表现，遗传操作手段应用于改善脂肪酶的酶学性能，在1994年，NovoNordisk公司首先引入了商业化的脂肪酶Lipolase，它是来源于真菌T.lanuginosus并且在A.oryzae中异源表达的脂肪酶[35]。由于洗涤工业通常处于碱性环境，筛选耐碱性的脂肪酶是首要考虑的因素，人们发现源于Acinetobacterradioresistens的碱性脂肪酶在pH=10时具有最大活性，并且在pH处于6-10之间具有很高的稳定性，极大提高了脂肪酶的应用价值[36-38]。
华中科技大学博士学位论文12联到特异的启动子元件，激活或者抑制下游蛋白的表达[85-87]。在铜绿假单胞菌中，存在两种群体信号分子，LasI/R和RhlI/R系统[88-92]。在两种系统中生成的胞外信号分子是酰基高丝氨酸内酯。当其偶联上同源蛋白LasR或者RhlR时，许多下游基因被激活，这些基因可编码许多胞外酶和毒性因子，例如脂肪酶、碱性蛋白酶、弹性蛋白酶、外毒素A和胞外酶S。另外，细菌的蠕动、膜的形成和鼠李糖脂的生产都受到这个机制的调控[93,94]。因为QS系统是一个非常复杂的网络，在转录和翻译水平都发挥相应调节作用，并且它受到全局调控因子的调节，这个系统在本文中不做深入讨论[94]。有关于脂肪酶表达的研究，RhlI/R系统可间接调节脂肪酶的表达[69]。鉴别了处于lipAH操纵子上游σ54依靠的启动子序列后，利用Tn5转座子技术筛选出了二元调控元件LipQ/R[95]。二元调控系统由一个传感器蛋白激酶和一个应答调控元件组成，展示了细菌适应细胞浓度和环境因子的另外一类重要的调控机制[96]。环境因子可以诱导传感器激酶组氨酸残基的自磷酸化，之后磷酸化形态转移到应答元件的天冬氨酸残基上，从而激活了目标基因的表达[97,98]。图1.3铜绿假单胞菌中脂肪酶基因的表达调控[69]。Fig.1.3RegulationoflipasegeneexpressioninP.aeruginosa[69].在铜绿假单胞菌的LipQ/R调控元件中，传感器激酶LipQ似乎也能被转录调控因子RhlR激活，也可能是某种位置的环境信号，又或者是由于错误折叠蛋白引发周质发出的信号。激活的转录调控因子LipR偶联到上游激活序列（UAS），其来源于lipAH
【参考文献】：
期刊论文
[1]带His-tag的解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2在毕赤酵母中的表达及纯化[J]. 汪小锋,申旭光,赵鹤云,孙永川,纪昌涛,闫云君. 中国生物工程杂志. 2011(04)
[2]微生物脂肪酶蛋白质工程[J]. 林瑞凤,舒正玉,薛龙吟,江欢,黄建忠. 中国生物工程杂志. 2009(09)
[3]转录组与蛋白质组比较研究进展[J]. 吴松锋,朱云平,贺福初. 生物化学与生物物理进展. 2005(02)
博士论文
[1]脂肪酶/酯酶的理性设计和改造研究[D]. 李冠霖.华中科技大学 2018
[2]立体选择性脂肪酶在手性化合物拆分中的应用基础研究[D]. 戴大章.浙江大学 2006
[3]脂肪酶催化拆分N取代苯基α氨基丙酸的研究[D]. 郑良玉.吉林大学 2004
本文编号：3043490
【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：160 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
经典的α/β水解酶折叠子[1]
华中科技大学博士学位论文4理化性质的深入研究中发现，脂肪酶具有独特的化学选择性、位置选择性和立体选择性，不要求辅助因子，且可以在微生物中高效表达[2]。因此，它们具有极大的工业应用价值，广泛应用于农业化学品、药品、洗涤剂、食品和乳制品中[32,33]。图1.2脂肪酶的催化机制[1]Fig.1.2Thecatalyticmechanismoflipase[1]1.3.1脂肪酶在清洁剂工业的应用脂肪酶商业化应用需求较大的一个领域就是它作为洗涤剂的添加物，居民家庭清洁和工业部门的洗涤需求对于这类酶有极大的需求[34]。为了提高脂肪酶在洗涤工业的表现，遗传操作手段应用于改善脂肪酶的酶学性能，在1994年，NovoNordisk公司首先引入了商业化的脂肪酶Lipolase，它是来源于真菌T.lanuginosus并且在A.oryzae中异源表达的脂肪酶[35]。由于洗涤工业通常处于碱性环境，筛选耐碱性的脂肪酶是首要考虑的因素，人们发现源于Acinetobacterradioresistens的碱性脂肪酶在pH=10时具有最大活性，并且在pH处于6-10之间具有很高的稳定性，极大提高了脂肪酶的应用价值[36-38]。
华中科技大学博士学位论文12联到特异的启动子元件，激活或者抑制下游蛋白的表达[85-87]。在铜绿假单胞菌中，存在两种群体信号分子，LasI/R和RhlI/R系统[88-92]。在两种系统中生成的胞外信号分子是酰基高丝氨酸内酯。当其偶联上同源蛋白LasR或者RhlR时，许多下游基因被激活，这些基因可编码许多胞外酶和毒性因子，例如脂肪酶、碱性蛋白酶、弹性蛋白酶、外毒素A和胞外酶S。另外，细菌的蠕动、膜的形成和鼠李糖脂的生产都受到这个机制的调控[93,94]。因为QS系统是一个非常复杂的网络，在转录和翻译水平都发挥相应调节作用，并且它受到全局调控因子的调节，这个系统在本文中不做深入讨论[94]。有关于脂肪酶表达的研究，RhlI/R系统可间接调节脂肪酶的表达[69]。鉴别了处于lipAH操纵子上游σ54依靠的启动子序列后，利用Tn5转座子技术筛选出了二元调控元件LipQ/R[95]。二元调控系统由一个传感器蛋白激酶和一个应答调控元件组成，展示了细菌适应细胞浓度和环境因子的另外一类重要的调控机制[96]。环境因子可以诱导传感器激酶组氨酸残基的自磷酸化，之后磷酸化形态转移到应答元件的天冬氨酸残基上，从而激活了目标基因的表达[97,98]。图1.3铜绿假单胞菌中脂肪酶基因的表达调控[69]。Fig.1.3RegulationoflipasegeneexpressioninP.aeruginosa[69].在铜绿假单胞菌的LipQ/R调控元件中，传感器激酶LipQ似乎也能被转录调控因子RhlR激活，也可能是某种位置的环境信号，又或者是由于错误折叠蛋白引发周质发出的信号。激活的转录调控因子LipR偶联到上游激活序列（UAS），其来源于lipAH
【参考文献】：
期刊论文
[1]带His-tag的解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2在毕赤酵母中的表达及纯化[J]. 汪小锋,申旭光,赵鹤云,孙永川,纪昌涛,闫云君. 中国生物工程杂志. 2011(04)
[2]微生物脂肪酶蛋白质工程[J]. 林瑞凤,舒正玉,薛龙吟,江欢,黄建忠. 中国生物工程杂志. 2009(09)
[3]转录组与蛋白质组比较研究进展[J]. 吴松锋,朱云平,贺福初. 生物化学与生物物理进展. 2005(02)
博士论文
[1]脂肪酶/酯酶的理性设计和改造研究[D]. 李冠霖.华中科技大学 2018
[2]立体选择性脂肪酶在手性化合物拆分中的应用基础研究[D]. 戴大章.浙江大学 2006
[3]脂肪酶催化拆分N取代苯基α氨基丙酸的研究[D]. 郑良玉.吉林大学 2004
本文编号：3043490
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3043490.html
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