酵母终止子工程：从机理探索到人工设计
发布时间：2021-03-01 22:06
生物系统的复杂性为生物元器件的构建提出了挑战,新型控制元件的发现和稳定可调节的元件设计成为合成生物学的重要内容之一。终止子作为基因元件独立于编码基因行使终止转录的功能,是一种重要的合成生物学控制元件。研究表明终止子作用有强有弱,终止子的选择会直接影响mRNA的量,并且随着终止子结构与功能的逐渐清晰和对转录终止机理的深入解析,以短小、可控、可设计为特征的终止子工程得以快速发展。本文以常规酿酒酵母为基础,系统总结了酿酒酵母中终止子元件在结构发现、功能表征、转录终止机理方面的最新研究进展,并讨论了终止子的人工设计及在途径工程精细调控领域的应用情况,展望了终止子工程面临的挑战、可能的解决途径及在非模式酵母中发展的潜力和意义。这为研究人员开发合成生物学元件和异源合成途径优化提供了科学的理论参考。
【文章来源】：合成生物学. 2020,1(06)
【文章页数】：13 页
【部分图文】：
酿酒酵母终止子的基本结构与表征方法[13]
终止子通过切割因子IA、切割因子IB识别自身效率元件和位置元件进行3′末端的加工和切割。而多聚腺苷酸化反应首先由切割因子IB和CPF蛋白质复合物识别终止子元件上的ploy(A）位点及围绕ploy(A）位点的富U/GU区域进行切割，在多聚腺苷酸聚合酶的催化下，3′末端会合成具有一定长度的ploy(A）尾巴，将m RNA从细胞核内转运至细胞质中翻译成蛋白质[55-57]。切割因子IA、IB的亚基根据其不同的蛋白质结构域和裸露在外的氨基酸残基行使不同的功能，结合不同的终止子区域（图2）。突变或过表达切割因子IA、IB均会造成转录终止缺陷，但并不会完全停止转录。同样，终止子的缺失可能延长转录过程造成下游基因的通读，导致目标基因和蛋白质表达量的减少[58-59]。遗传和功能研究表明转录终止因子与RNA的精确结合对于3′末端转录终止有巨大作用，在当前的酿酒酵母转录终止因子研究中，仅有非编码蛋白Nrd1、Nab3在全基因组上的靶标RNA序列研究较为清楚，分别识别UGUAG/A和UCUUG[60-62]。另外，目前已确认转录终止因子Pcf11、Rtt103、Mbp1、Fkh1主要作用于聚腺苷酸化反应，但它们如何与终止子结合行使终止功能还不完全清楚[63-66]。在上述转录终止因子中，发现切割因子IB家族包含的转录终止因子Pcf11与裂殖酵母、哺乳动物、人、果蝇等中都含有类似的功能同系物，并贯穿于整个转录终止过程，推测Pcf11具有多种功能[67-71]。第一，Pcf11能够识别终止子区域上的位置元件，利用自身蛋白质结构域招募蛋白质因子Clp1、Rna14、Rna15和切割与多聚腺苷酸化因子CPF共同完成3′末端加工过程，同时促进新生pre-RNA链从DNA-RNA-RNA复合物中释放，促进转录终止[72-73]。第二，Pcf11介导与ploy(A）位点相关的切割和多聚腺苷酸化反应，在ploy(A）位点处完成切割并添加ploy(A）尾巴，促进m RNA成熟，并与非编码RNA结合切割内含子连接外显子，构建不同长度的转录本[74-75]。第三，在转录延伸过程进行到3′末端时，Pcf11蛋白发生磷酸化反应与RNAP II Rbp1亚基CTD区域中磷酸化的Ser2、Ser5结合，促进m RNA切割、RNAP II从DNA模板链上的解离，开启下一轮转录[76-79]。总之，转录终止因子Pcf11通过识别终止子元件，参与m RNA3′末端的加工和聚腺苷酸化反应，既能影响转录终止的时机又能调控m RNA的稳定性，对转录过程具有全局调控作用，是一种重要的潜在全局调控元件。然而，目前对其具体的转录终止机制还不清楚，特别是关于Pcf11是如何与终止序列识别并响应的、它的靶标RNA如何、Pcf11是如何参与聚腺苷酸化反应进行poly(A）的位点选择的。相信通过构建转录终止因子Pcf11等缺失菌株，利用高通量方法深入分析转录终止因子与终止子的结合位点和规律，将会进一步实现在全基因组层面分析转录终止过程的详细调控网络，为转录终止机理提供新的研究线索。
表达增强型终止子使酿酒酵母基因表达效率比对照提高了11倍，与不使用终止子情况相比提高了35倍，为今后终止子人工设计提供了理论依据和设计规则：如荧光蛋白的表达量与效率元件的序列长度成正比；位置元件和poly(A）位点对荧光蛋白的表达量没有太大影响[104-105]。本课题组在优化效率元件、位置元件和poly(A）位点基础方面，进一步探讨了间隔区序列对终止子活性的贡献。在Guo首次描述定义酵母终止所需最小元素集的基础上，通过构建266个长度约60 bp的人工终止子文库，初步发现了一些规律：终止子活性随效率元件与位置元件间Linker 1序列GC含量的升高而降低，且随Linker 1序列中T的增加而增加；Linker 1序列GC含量对荧光蛋白表达量的影响要大于Linker 2序列；Linker 2序列构成的茎环对不同活性终止子具有不同程度的影响，降低弱、中等强度终止子的茎长有利于提高m RNA表达量和蛋白质产量[15,106]。这些研究充分证明终止子的活性是可以调节可以控制的，更短、最小序列的终止子可能被编入未来基因调控元件的设计和预测模型中，也将为理解终止子在基因表达调控中的作用提供重要信息。表1列举了常用酵母终止子的相关信息。4 终止子在酵母途径精细调控中的应用
【参考文献】：
期刊论文
[1]合成生物学设计技术[J]. 温栾,卢俊南,钟伟,戴俊彪. 中国细胞生物学学报. 2019(11)
[2]合成生物学:开启生命科学“会聚”研究新时代[J]. 赵国屏. 中国科学院院刊. 2018(11)
[3]合成生物学的关键技术及应用进展[J]. 邢玉华,谭俊杰,李玉霞,凌焱,刘刚,陈惠鹏. 中国医药生物技术. 2012(05)
本文编号：3058097
【文章来源】：合成生物学. 2020,1(06)
【文章页数】：13 页
【部分图文】：
酿酒酵母终止子的基本结构与表征方法[13]
终止子通过切割因子IA、切割因子IB识别自身效率元件和位置元件进行3′末端的加工和切割。而多聚腺苷酸化反应首先由切割因子IB和CPF蛋白质复合物识别终止子元件上的ploy(A）位点及围绕ploy(A）位点的富U/GU区域进行切割，在多聚腺苷酸聚合酶的催化下，3′末端会合成具有一定长度的ploy(A）尾巴，将m RNA从细胞核内转运至细胞质中翻译成蛋白质[55-57]。切割因子IA、IB的亚基根据其不同的蛋白质结构域和裸露在外的氨基酸残基行使不同的功能，结合不同的终止子区域（图2）。突变或过表达切割因子IA、IB均会造成转录终止缺陷，但并不会完全停止转录。同样，终止子的缺失可能延长转录过程造成下游基因的通读，导致目标基因和蛋白质表达量的减少[58-59]。遗传和功能研究表明转录终止因子与RNA的精确结合对于3′末端转录终止有巨大作用，在当前的酿酒酵母转录终止因子研究中，仅有非编码蛋白Nrd1、Nab3在全基因组上的靶标RNA序列研究较为清楚，分别识别UGUAG/A和UCUUG[60-62]。另外，目前已确认转录终止因子Pcf11、Rtt103、Mbp1、Fkh1主要作用于聚腺苷酸化反应，但它们如何与终止子结合行使终止功能还不完全清楚[63-66]。在上述转录终止因子中，发现切割因子IB家族包含的转录终止因子Pcf11与裂殖酵母、哺乳动物、人、果蝇等中都含有类似的功能同系物，并贯穿于整个转录终止过程，推测Pcf11具有多种功能[67-71]。第一，Pcf11能够识别终止子区域上的位置元件，利用自身蛋白质结构域招募蛋白质因子Clp1、Rna14、Rna15和切割与多聚腺苷酸化因子CPF共同完成3′末端加工过程，同时促进新生pre-RNA链从DNA-RNA-RNA复合物中释放，促进转录终止[72-73]。第二，Pcf11介导与ploy(A）位点相关的切割和多聚腺苷酸化反应，在ploy(A）位点处完成切割并添加ploy(A）尾巴，促进m RNA成熟，并与非编码RNA结合切割内含子连接外显子，构建不同长度的转录本[74-75]。第三，在转录延伸过程进行到3′末端时，Pcf11蛋白发生磷酸化反应与RNAP II Rbp1亚基CTD区域中磷酸化的Ser2、Ser5结合，促进m RNA切割、RNAP II从DNA模板链上的解离，开启下一轮转录[76-79]。总之，转录终止因子Pcf11通过识别终止子元件，参与m RNA3′末端的加工和聚腺苷酸化反应，既能影响转录终止的时机又能调控m RNA的稳定性，对转录过程具有全局调控作用，是一种重要的潜在全局调控元件。然而，目前对其具体的转录终止机制还不清楚，特别是关于Pcf11是如何与终止序列识别并响应的、它的靶标RNA如何、Pcf11是如何参与聚腺苷酸化反应进行poly(A）的位点选择的。相信通过构建转录终止因子Pcf11等缺失菌株，利用高通量方法深入分析转录终止因子与终止子的结合位点和规律，将会进一步实现在全基因组层面分析转录终止过程的详细调控网络，为转录终止机理提供新的研究线索。
表达增强型终止子使酿酒酵母基因表达效率比对照提高了11倍，与不使用终止子情况相比提高了35倍，为今后终止子人工设计提供了理论依据和设计规则：如荧光蛋白的表达量与效率元件的序列长度成正比；位置元件和poly(A）位点对荧光蛋白的表达量没有太大影响[104-105]。本课题组在优化效率元件、位置元件和poly(A）位点基础方面，进一步探讨了间隔区序列对终止子活性的贡献。在Guo首次描述定义酵母终止所需最小元素集的基础上，通过构建266个长度约60 bp的人工终止子文库，初步发现了一些规律：终止子活性随效率元件与位置元件间Linker 1序列GC含量的升高而降低，且随Linker 1序列中T的增加而增加；Linker 1序列GC含量对荧光蛋白表达量的影响要大于Linker 2序列；Linker 2序列构成的茎环对不同活性终止子具有不同程度的影响，降低弱、中等强度终止子的茎长有利于提高m RNA表达量和蛋白质产量[15,106]。这些研究充分证明终止子的活性是可以调节可以控制的，更短、最小序列的终止子可能被编入未来基因调控元件的设计和预测模型中，也将为理解终止子在基因表达调控中的作用提供重要信息。表1列举了常用酵母终止子的相关信息。4 终止子在酵母途径精细调控中的应用
【参考文献】：
期刊论文
[1]合成生物学设计技术[J]. 温栾,卢俊南,钟伟,戴俊彪. 中国细胞生物学学报. 2019(11)
[2]合成生物学:开启生命科学“会聚”研究新时代[J]. 赵国屏. 中国科学院院刊. 2018(11)
[3]合成生物学的关键技术及应用进展[J]. 邢玉华,谭俊杰,李玉霞,凌焱,刘刚,陈惠鹏. 中国医药生物技术. 2012(05)
本文编号：3058097
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3058097.html
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