光片荧光显微成像技术及应用进展
发布时间：2021-03-09 12:52
生物医学研究的发展对光学显微成像的性能,如空间分辨率、成像速度、多维度信息、成像质量等提出了更高的要求。光片荧光显微采用一个薄片光从侧面激发样品,在正交方向探测成像,具有快速三维层析成像和对样品光漂白和光毒性小的优点,是活体生物样品长时间显微观测的理想工具。本文介绍了光片荧光显微成像技术的基本原理及其主要特点;综述了光片荧光显微面临的主要技术问题,以及为解决这些问题而发展出的新原理、新思路和新方法;例举了光片荧光显微成像技术在细胞生物学、发育生物学和神经科学等领域的应用;讨论了该技术的发展趋势及前景。该研究旨在帮助研究者系统了解光片荧光显微成像技术的基本知识、最新研究发展趋势和潜在应用,为该领域科学研究提供参考。
【文章来源】：激光与光电子学进展. 2020,57(10)北大核心
【文章页数】：15 页
【部分图文】：
图1 两种显微成像方式对比。（a）光片荧光显微从侧面用薄光片照明，只激发探测物镜焦平面处的样品发射荧光，在正交方向上收集荧光信号成像；（b）落射式荧光显微用同一物镜激发和收集荧光，光路经过的在焦和离焦样品都会被激发
图1 两种显微成像方式对比。（a）光片荧光显微从侧面用薄光片照明，只激发探测物镜焦平面处的样品发射荧光，在正交方向上收集荧光信号成像；（b）落射式荧光显微用同一物镜激发和收集荧光，光路经过的在焦和离焦样品都会被激发3 光片荧光显微的主要技术问题
研究人员通过扫描具有无衍射特性的贝塞尔光束、艾里光束等生成如图3(b）和（c）所示的新型光片场，以解决光片荧光显微系统观测视场与轴向分辨率相互制约的问题。Planchon等[15]通过一维扫描传播过程中能维持光束形貌不变的零阶贝塞尔光束生成强度均匀的贝塞尔光片，然而贝塞尔光束的同心环状旁瓣产生的离焦背景噪声，既降低了成像对比度和系统轴向分辨率，又增大了光漂白和光毒性效应。Fahrbach等[42]结合共聚焦技术解决了贝塞尔光片荧光显微成像对比度和轴向分辨率低的问题，然而该方法合成一幅高对比度的二维图像需要拍摄上百幅低对比度的图像，系统的成像速度降低了两个数量级。Olarte等[43]利用双光子激发荧光有效抑制了贝塞尔光束旁瓣产生的离焦背景噪声，并保证了系统的成像速度，但高强度超短飞秒光脉冲的光漂白性强且难以进行多色荧光成像。Vettenburg等[44]将艾里光片应用到光片荧光显微中，在保证轴向分辨率前提下将视场扩大了10倍（视场173μm×173μm，轴向分辨率0.86μm），但是艾里光片照明得到的荧光图像必须进行去卷积处理才能真实还原出样品信息。本课题组也开展了基于无衍射光束的光片荧光显微研究，提出了互补光束相减光片荧光显微成像技术（CBS-LSFM)[29]，它的原理如图4所示。该方法的核心是设计并实验生成贝塞尔光束的互补光束，该互补光束也具有无衍射特性，可满足大视场成像需求；扫描该光束生成的互补光片中心光强为零，其他位置处强度分布和贝塞尔光片旁瓣强度分布一致[45]。分别用贝塞尔光片和互补光片照明样品拍摄两幅荧光图像，然后将二者相减，可消除贝塞尔光束旁瓣对成像的影响，从而实现大视场高轴向分辨率成像（视场300μm×210μm，轴向分辨率1μm，横向分辨率0.45μm）。互补光片相减法用于光片荧光显微同时引起其他科研人员的关注和研究[38,46]。为解决实验系统噪声影响成像质量的问题，我们提出了一种基于压缩感知盲解卷和去噪图像处理方法[30]。该方法可同时对荧光图像进行解卷和去噪处理，可有效抑制伪影，将信噪比提高2倍，显著提高图像对比度和质量。互补光束相减法需要拍摄两幅荧光图像才能计算出一幅高分辨、高质量的图像，成像速度受到一定限制且会额外增加光剂量。为了解决该问题，利用深度学习进行图像处理，可以直接从传统的贝塞尔光片拍摄的图像计算出与互补光片相减法一致的高质量图片，有效提高了成像速度并降低曝光剂量[31]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]超分辨光学显微的成像原理及应用进展[J]. 付芸,王天乐,赵森. 激光与光电子学进展. 2019(24)
[2]光片荧光显微镜长时间的稳定成像[J]. 张球,梁东,白丽华,刘军. 中国激光. 2019(04)
[3]Sidelobe suppression in light-sheet fluorescence microscopy with Bessel beam plane illumination using subtractive imaging[J]. 邓素辉,肖轶平,胡杰,陈建芳,王玉皞,刘明萍. Chinese Optics Letters. 2018(11)
[4]贝塞尔光束的互补光束设计与优化[J]. 贾昊,于湘华,杨延龙,周兴,严绍辉,刘超,雷铭,姚保利. 光子学报. 2018(07)
[5]结合光片照明与超分辨的三维荧光显微成像[J]. 谢新林,陈蓉,赵宇轩,费鹏. 中国激光. 2018(03)
[6]基于荧光随机涨落的超分辨显微成像[J]. 曾志平. 中国激光. 2018(03)
[7]光片荧光显微成像[J]. 杨豫龙,宗伟建,吴润龙,陈良怡. 光学学报. 2017(03)
[8]结合去卷积的艾里光束片状光显微成像研究[J]. 徐豪,张运海,张欣,肖昀,黄维. 光学学报. 2017(03)
[9]组织透明技术[J]. 王培新,张丹,尚爱加,侯冰. 神经解剖学杂志. 2016(01)
[10]高分辨和超分辨光学成像技术在空间和生物中的应用[J]. 姚保利,雷铭,薛彬,郜鹏,严绍辉,赵惠,赵卫,杨建峰,樊学武,邱跃洪,高伟,赵葆常,李英才. 光子学报. 2011(11)
本文编号：3072880
【文章来源】：激光与光电子学进展. 2020,57(10)北大核心
【文章页数】：15 页
【部分图文】：
图1 两种显微成像方式对比。（a）光片荧光显微从侧面用薄光片照明，只激发探测物镜焦平面处的样品发射荧光，在正交方向上收集荧光信号成像；（b）落射式荧光显微用同一物镜激发和收集荧光，光路经过的在焦和离焦样品都会被激发
图1 两种显微成像方式对比。（a）光片荧光显微从侧面用薄光片照明，只激发探测物镜焦平面处的样品发射荧光，在正交方向上收集荧光信号成像；（b）落射式荧光显微用同一物镜激发和收集荧光，光路经过的在焦和离焦样品都会被激发3 光片荧光显微的主要技术问题
研究人员通过扫描具有无衍射特性的贝塞尔光束、艾里光束等生成如图3(b）和（c）所示的新型光片场，以解决光片荧光显微系统观测视场与轴向分辨率相互制约的问题。Planchon等[15]通过一维扫描传播过程中能维持光束形貌不变的零阶贝塞尔光束生成强度均匀的贝塞尔光片，然而贝塞尔光束的同心环状旁瓣产生的离焦背景噪声，既降低了成像对比度和系统轴向分辨率，又增大了光漂白和光毒性效应。Fahrbach等[42]结合共聚焦技术解决了贝塞尔光片荧光显微成像对比度和轴向分辨率低的问题，然而该方法合成一幅高对比度的二维图像需要拍摄上百幅低对比度的图像，系统的成像速度降低了两个数量级。Olarte等[43]利用双光子激发荧光有效抑制了贝塞尔光束旁瓣产生的离焦背景噪声，并保证了系统的成像速度，但高强度超短飞秒光脉冲的光漂白性强且难以进行多色荧光成像。Vettenburg等[44]将艾里光片应用到光片荧光显微中，在保证轴向分辨率前提下将视场扩大了10倍（视场173μm×173μm，轴向分辨率0.86μm），但是艾里光片照明得到的荧光图像必须进行去卷积处理才能真实还原出样品信息。本课题组也开展了基于无衍射光束的光片荧光显微研究，提出了互补光束相减光片荧光显微成像技术（CBS-LSFM)[29]，它的原理如图4所示。该方法的核心是设计并实验生成贝塞尔光束的互补光束，该互补光束也具有无衍射特性，可满足大视场成像需求；扫描该光束生成的互补光片中心光强为零，其他位置处强度分布和贝塞尔光片旁瓣强度分布一致[45]。分别用贝塞尔光片和互补光片照明样品拍摄两幅荧光图像，然后将二者相减，可消除贝塞尔光束旁瓣对成像的影响，从而实现大视场高轴向分辨率成像（视场300μm×210μm，轴向分辨率1μm，横向分辨率0.45μm）。互补光片相减法用于光片荧光显微同时引起其他科研人员的关注和研究[38,46]。为解决实验系统噪声影响成像质量的问题，我们提出了一种基于压缩感知盲解卷和去噪图像处理方法[30]。该方法可同时对荧光图像进行解卷和去噪处理，可有效抑制伪影，将信噪比提高2倍，显著提高图像对比度和质量。互补光束相减法需要拍摄两幅荧光图像才能计算出一幅高分辨、高质量的图像，成像速度受到一定限制且会额外增加光剂量。为了解决该问题，利用深度学习进行图像处理，可以直接从传统的贝塞尔光片拍摄的图像计算出与互补光片相减法一致的高质量图片，有效提高了成像速度并降低曝光剂量[31]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]超分辨光学显微的成像原理及应用进展[J]. 付芸,王天乐,赵森. 激光与光电子学进展. 2019(24)
[2]光片荧光显微镜长时间的稳定成像[J]. 张球,梁东,白丽华,刘军. 中国激光. 2019(04)
[3]Sidelobe suppression in light-sheet fluorescence microscopy with Bessel beam plane illumination using subtractive imaging[J]. 邓素辉,肖轶平,胡杰,陈建芳,王玉皞,刘明萍. Chinese Optics Letters. 2018(11)
[4]贝塞尔光束的互补光束设计与优化[J]. 贾昊,于湘华,杨延龙,周兴,严绍辉,刘超,雷铭,姚保利. 光子学报. 2018(07)
[5]结合光片照明与超分辨的三维荧光显微成像[J]. 谢新林,陈蓉,赵宇轩,费鹏. 中国激光. 2018(03)
[6]基于荧光随机涨落的超分辨显微成像[J]. 曾志平. 中国激光. 2018(03)
[7]光片荧光显微成像[J]. 杨豫龙,宗伟建,吴润龙,陈良怡. 光学学报. 2017(03)
[8]结合去卷积的艾里光束片状光显微成像研究[J]. 徐豪,张运海,张欣,肖昀,黄维. 光学学报. 2017(03)
[9]组织透明技术[J]. 王培新,张丹,尚爱加,侯冰. 神经解剖学杂志. 2016(01)
[10]高分辨和超分辨光学成像技术在空间和生物中的应用[J]. 姚保利,雷铭,薛彬,郜鹏,严绍辉,赵惠,赵卫,杨建峰,樊学武,邱跃洪,高伟,赵葆常,李英才. 光子学报. 2011(11)
本文编号：3072880
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