基于RSV病毒和九个细菌耐药基因的两种新型qPCR检测方法的建立

发布时间：2021-03-09 12:26

　　传染病是一类由各种病原体引起的具有传染性和流行性的疾病。病毒和细菌是引起多数传染病的主要病原体。基于Taq Man探针的实时荧光定量PCR（q PCR）常用于病毒和细菌的诊断或定量。具有高变异特性的病毒（尤其是RNA病毒）限制q PCR扩增的检测能力和效率。此外,随着细菌对临床常用抗生素的耐药性日益增加,多重耐药细菌不断增多,传统q PCR难以实现单管对多个耐药基因同时检测。基于上述问题,本研究分别建立了两种q PCR检测方法,主要研究内容如下:（1）RSV耐错配型q PCR检测方法的构建呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）是导致婴幼儿急性呼吸道感染的主要病毒病原体之一。RSV感染的及时诊断,对治疗和预防RSV感染很重要。本部分基于高保真DNA聚合酶的3’-5’外切酶特性,建立了一种新型耐错配的q PCR,并应用于RSV的检测,与传统q PCR相比,该法对突变体的扩增效率更高并具有良好的灵敏度和特异性,检测限可达1.8 PFU/m L。该法对80%RSV阳性样品检测的Ct值相对较低,通过对这些样本进行测序分析发现,样本与引物3’端有错配,证明... 

【文章来源】：上海大学上海市 211工程院校

【文章页数】：81 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

qPCR染料法原理

上海大学硕士学位论文9图1.2TaqMan探针原理Figure1.2PrincipleofTaqManprobe②TaqMan探针（MGB）TaqMan-MGB探针是将水解探针的淬灭集团替换成了非荧光淬灭基团，从而大大降低本底信号的强度[61]。同时探针上还连接有MGB(MinorGrooveBinder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高5°C-10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan水解探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。③分子信标分子信标是一种发夹结构的探针，和TaqMan探针一样，其两端也有荧光基团和淬灭基团修饰（图1.3）[62]。体系中无模板时，探针发夹结构维持稳定，释放出的荧光信号非常微弱；体系中存在模板时，探针部分序列和模板特异结合，破坏发卡结构使修饰的基团分离，因而仪器可以接收到强烈的荧光信号[63]。分子信标广泛运用于病原体检测和单核苷酸多态性检测[64,65]等方面。

上海大学硕士学位论文10图1.3分子信标原理Figure1.3PrinciplesofMolecularBeacons④其它荧光探针双杂交探针（如图1.4A）是两个特异性探针，一个只5’端标记荧光基团，另一个只3’端标记猝灭基团。这两个探针序列和模板特异性结合，结合的位置非常邻近[66]。在qPCR反应的退火阶段，当两个探针与模板结合时，位于两个探针头尾的荧光基团之间产生FRET现象，促进受体的荧光基团释放一种波长的荧光信号，从而达到实时监控反应进程的目的。Amplifluor系统[67]（如图1.4B）包括两个特异性引物和一条通用引物（UniPrimer），其中一条引物的5’末端带有部分序列和UniPrimer的3’末端部分序列相同。UniPrimer两端分别被荧光和淬灭基团标记且有发卡结构。反应时，UniPrimer结合到特异性引物扩增出的模板上作为引物进行PCR反应，在延伸的过程中UniPrimer发夹结构打开，荧光信号释放。蝎形引物[68]（如图1.4C）为茎环结构，其5’端带有一个荧光基团FAM，3’端带有一个淬灭基团DABCYL，其环的部分序列和模板完全互补配对。体系有模板时，茎环结构稳定，荧光和淬灭基团相距近，不能检出荧光信号；体系无模板时，蝎形引物和模板特异性结合并起始PCR扩增，蝎形引物的环结构与扩增出的模板互补杂交，导致茎环结构被破坏，释放出大量的荧光信号，荧光仪器可以实时收集这些荧光信号并生成相应的荧光扩增曲线。

【参考文献】：
期刊论文
[1]细菌耐药耐受性机制的最新研究进展[J]. 李昕,曾洁,王岱,薛云新,赵西林.  中国抗生素杂志. 2020(02)
[2]实时荧光定量RT-PCR快速检测四种呼吸道病毒的研究[J]. 向蕾,陈仕菊,王昕,吕星,陆家海,房师松.  热带医学杂志. 2014(04)
[3]抗生素的细菌耐药性及应对措施[J]. 任祥友,蒋瑞芹,崔玉芹.  中国民康医学. 2010(13)



本文编号：3072846