阿耶氏芽孢杆菌酯酶的分离纯化、基因克隆与表达及其应用研究

发布时间：2021-03-16 04:10

　　(S)-吲哚啉-2-羧酸作为高血压治疗药物培哚普利的关键中间体,其生产效率和纯度将直接影响下游药物的价格和质量。目前,高光学纯的（S）-吲哚啉-2-羧酸主要由化学法制备,但此类方法所需的手性助剂价格昂贵、难以回收,增加工业生产成本的同时还对环境造成了一定的压力。而国内外通过生物酶法制备（S）-吲哚啉-2-羧酸的报道较少,本实验室从自然环境中筛选到了一株能立体选择性拆分（R,S）-吲哚啉-2-羧酸乙酯的菌株Bacillus aryabhattai B8W22,本课题是在此基础上从该菌株中分离纯化出具有立体选择性的酯酶,并构建基因工程菌,优化其工业催化条件,以期可以大规模生产（S）-吲哚啉-2-羧酸,主要研究结果如下:1.利用DEAE阴离子交换层析和辛基疏水作用层析,从Bacillus aryabhattai B8W22中纯化出能手性拆分（R,S）-吲哚啉-2-羧酸乙酯的酯酶,酶的比活力从0.01U/mg增加到0.57 U/mg,纯化倍数为59倍,产率为20%。MALDI-TOF鉴定显示该蛋白为羧酸酯酶（WP＿013057000.1）,分子量为34705 Da,与SDS-PAGE电泳条带大... 

【文章来源】：浙江工业大学浙江省

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

(S)-吲哚啉-2-羧酸结构式Figure1-1.Structuralformulaof(S)-indoline-2-carboxylicacid

阿耶氏芽孢杆菌酯酶的分离纯化、基因克隆与表达及其应用研究17图2-1酯酶分离纯化电泳图Figure2-1.Electrophoresismapofesterasepurification（A）Native-PAGE(8%)：第1、4泳道为粗酶液；第2、5泳道为DEAE阴离子交换层析纯化的样品；第3、6泳道为辛基疏水作用层析纯化的样品；泳道1、2、3进行银染，泳道4、5、6进行酯酶活性染色。（B）SDS-PAGE（12%）：泳道M为蛋白marker26616；泳道1为辛基疏水作用层析纯化的样品；凝胶进行银染。2.4.3蛋白质谱鉴定使用MALDI-TOFMS（图2-2）鉴定该蛋白为羧酸酯酶（WP_013057000.1）。其分子量为34705Da，与SDS-PAGE结果一致。这些结果表明从阿耶氏芽孢杆菌BacillusaryabhattaiB8W22中纯化的酯酶是单体。图2-2蛋白质谱鉴定图Figure2-2.Themapofproteinmassspectrumidentification

阿耶氏芽孢杆菌酯酶的分离纯化、基因克隆与表达及其应用研究17图2-1酯酶分离纯化电泳图Figure2-1.Electrophoresismapofesterasepurification（A）Native-PAGE(8%)：第1、4泳道为粗酶液；第2、5泳道为DEAE阴离子交换层析纯化的样品；第3、6泳道为辛基疏水作用层析纯化的样品；泳道1、2、3进行银染，泳道4、5、6进行酯酶活性染色。（B）SDS-PAGE（12%）：泳道M为蛋白marker26616；泳道1为辛基疏水作用层析纯化的样品；凝胶进行银染。2.4.3蛋白质谱鉴定使用MALDI-TOFMS（图2-2）鉴定该蛋白为羧酸酯酶（WP_013057000.1）。其分子量为34705Da，与SDS-PAGE结果一致。这些结果表明从阿耶氏芽孢杆菌BacillusaryabhattaiB8W22中纯化的酯酶是单体。图2-2蛋白质谱鉴定图Figure2-2.Themapofproteinmassspectrumidentification


本文编号：3085382