拟南芥N 6 -mAMP脱氨酶ADAL结构与催化机制研究

发布时间：2021-03-25 07:15

　　N⁶-甲基化腺嘌呤核苷酸（m⁶A）修饰是迄今为止在真核生物中发现最多的m RNA水平上的修饰,具有重要的生物学功能。N⁶-甲基化腺嘌呤核苷单磷酸（N⁶-m AMP）被认为是含有m⁶A修饰的RNA代谢产生的中间产物,如果不及时周转,将会被RNA聚合酶II（Pol II）错误地插入到新合成的RNA中。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中,脱氨酶ADAL（Adenosine Deaminase-Like）被证实可以促进N⁶-m AMP的代谢,催化N⁶-m AMP反应生成次黄嘌呤核苷单磷酸（IMP）以阻止N⁶-m AMP错误地插入到新合成的RNA中。虽然该蛋白的功能被报道,但是ADAL蛋白的三维结构还未被解析。在本论文中我们第一次运用蛋白质晶体学手段解析了AtADAL蛋白的晶体结构,发现该蛋白由中间的9个平行β-strand和外围的15个-helices组成,属于典型的TIM桶式结构。在其活性位点中有一... 

【文章来源】：哈尔滨工业大学黑龙江省 211工程院校 985工程院校

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鉴定阳性单克隆菌株结果

哈尔滨工业大学理学硕士学位论文-23-少量对应菌株的菌液送生物公司测序，1天后收到测序结果，与已有基因序列比对均无误。从中任意挑选一个菌株保存。2.3.2AtADAL蛋白纯化蛋白质序列分析发现其中含有一个锌指结构，所以在第一次摇菌时向培养基中引入了锌离子，其余实验步骤没有变化。将引入锌离子的菌液高压机械破碎、离心后取上清液先用一个Ni-NTA纯化树脂预装柱初步纯化分离AtADAL蛋白，收集洗脱样品跑SDSPAGE电泳，实验结果如图2-2所示。图2-2引入锌离子的菌液初步纯化结果如图2-2所示，在全菌液泳道中可以看到在目的蛋白大小处有蛋白条带，在上清液泳道中在该处未见明显的蛋白条带，从Ni-NTA纯化树脂预装柱上洗脱下的样品中同样也在该处看不到明显的蛋白条带，重复这个实验后得到同样的结果。所以决定重新培养菌株时不引入锌离子，重复相同的纯化实验操作后实验结果如图2-3所示。如图2-3所示，胶图中在目的蛋白大小附近有清晰的蛋白条带，蛋白表达量较大，洗脱样品中还含有少量其他杂蛋白，且此时目的蛋白还带有His6-SUMO纯化上样量：7μL

哈尔滨工业大学理学硕士学位论文-24-标签，要想得到符合晶体生长要求的蛋白样品，还需要进一步从洗脱样品中纯化分离AtADAL蛋白。图2-3未引入锌离子后AtADAL蛋白初步纯化结果Ni-NTA纯化树脂预装柱上洗脱下的蛋白样品经Ulp1酶切透析后His6-SUMO纯化标签与AtADAL蛋白分开，用两个串联的Ni-NTA纯化树脂预装柱去除切掉的纯化标签和未切开的蛋白，流出液样品浓缩后经分子筛纯化，结果如图2-4所示。按分子筛纯化结果图收集AtADAL蛋白样品，跑SDSPAGE电泳检测蛋白样品的纯度是否符合要求，结果如图2-5所示。图2-4AtADAL蛋白分子筛HiLoad16/600Superdex200-pgcolumn纯化结果峰值在84.86ml处，流速为1ml/min。上样量：7μL


本文编号：3099280