基于CRISPR/cas9系统高效编辑小鼠Galt基因

发布时间：2021-03-29 22:57

　　GALT基因突变是人类I型半乳糖血症的主要病因。拟通过CRISPR/cas9系统打靶小鼠Galt基因以模拟人GALT基因突变,从而为建立精准模拟I型半乳糖血症的动物模型奠定基础。首先分析了我国I型半乳糖血症GALT基因的致病突变位点,并将其定位在小鼠Glat基因上,作为小鼠Galt基因的拟突变位点,然后根据拟突变位点区域的序列设计了sgRNA导向序列,构建sgRNA表达质粒,将其与cas9表达质粒共转染小鼠3T3细胞,通过嘌呤霉素和杀稻瘟菌素筛选阳性转染细胞,提取阳性细胞基因组DNA,PCR扩增打靶位点的DNA片段,通过TA克隆测序鉴定基因编辑情况并分析编辑效率。结果表明,3个sgRNA导向序列均可以通过CRISPR/Cas9系统高效编辑小鼠Galt基因,编辑效率为100%。 

【文章来源】：生物技术通报. 2020,36(08)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

模拟人GALT基因突变的小鼠Galt基因打靶位点示意图及其序列

本研究设计的sgRNA在Galt基因上的靶序列符合5"-N(21)GG的序列排列规则，且在Galt基因上的靶序列是唯一的。筛选出的3条sgRNA的核苷酸序列分别为：sgRNA1:5"-agccttaccatgccagccca-3";sgRNA2:5"-ctccatgggctggcatggta-3";sgRNA3:5"-ggctggcatggtaaggcttt-3"。按本研究实验方法构建的pGL3-U6-Galt-sgRNA质粒电泳图（图2),3种质粒大小符合预期。质粒的测序峰图（图3），阴影部分代表质粒中sgRNA编码序列，与设计的3条sgRNA相符，表明sgRNA表达载体初步构建成功。图3 sgRNA表达质粒测序峰图

sgRNA表达质粒测序峰图

【参考文献】：
期刊论文
[1]新生儿半乳糖血症筛查及基因谱分析[J]. 杨茹莱,童凡,洪芳,钱古柃,吴鼎文,赵正言.  中华儿科杂志. 2017 (02)



本文编号：3108349