C1orf109蛋白265/280氨基酸转录本稳定性及其降解机制研究
发布时间：2021-04-03 04:28
在哺乳动物细胞中,必须严格控制蛋白质的更新速率,因为很多新合成的蛋白质会迅速降解,同时,受损或错误折叠的蛋白质也需要迅速降解,以保持细胞的新陈代谢。泛素-蛋白酶体系统是一种专门的蛋白质水解系统,可控制蛋白质降解并在维持细胞内蛋白质稳态中发挥着重要作用。其不仅在调节蛋白质稳态方面很重要,而且在与DNA损伤和修复,细胞增殖和存活,细胞分化以及耐药性有关的众多细胞调节中具有重要生物学功能。C1orf109作为一个新的蛋白分子,其发挥的生物学功能以及潜在的分子调控机制目前仍不清楚。在前期的研究中发现,C1orf109蛋白在多种肿瘤细胞中呈低表达,但是其低表达的原因尚不明确。因此,本课题对C1orf109蛋白265个氨基酸蛋白质（C1orf109-265）和280个氨基酸蛋白质（C1orf109-280）的稳定性及其发生降解的分子调控机制进行了初步探究。研究中利用放线菌酮处理He La和HEK-293T细胞来抑制蛋白质的合成,检测C1orf109-265和C1orf109-280蛋白的半衰期,发现C1orf109-265蛋白的半衰期要比C1orf109-280的半衰期长,C1orf109-265...
【文章来源】：哈尔滨工业大学黑龙江省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
HeLa细胞中C1orf109-265/280蛋白半衰期分析
哈尔滨工业大学理学硕士学位论文-30-3.2.2HEK-293T细胞中C1orf109蛋白半衰期检测为了进一步确认C1orf109蛋白在不同细胞中的半衰期是否存在差异或是相似，我们又将pCMV-Flag-C1orf109-265和pCMV-Flag-C1orf109-280两种表达质粒瞬时转染到HEK-293T细胞中，同样地，在转染24h后，将细胞换液为含有100μg/mL放线菌酮的DMEM培养基，在加入放线菌酮处理0h，0.5h，1h，2h，3h和4h时，分别收取细胞，加入100μL裂解液提取总蛋白，以β-actin蛋白作为内参，利用蛋白质免疫印迹技术检测C1orf109蛋白表达水平变化。实验结果如图3-2所示，从图中可以看出，与在HeLa细胞中相似，C1orf109-265蛋白和C1orf109-280蛋白在加入放线菌酮处理后，蛋白表达量逐渐下降，在4h时，两者表达量均接近于零，C1orf109-265蛋白的半衰期在2h-3h之间，C1orf109-280蛋白半衰期1h左右；对比来看，在HEK-293T细胞中，C1orf109-265蛋白比C1orf109-280蛋白半衰期长，较为稳定。图3-2HEK-293T细胞中C1orf109-265/280的半衰期分析a)C1orf109-265蛋白半衰期检测b)C1orf109-280蛋白半衰期检测c)C1orf109-265/280蛋白半衰期检测灰度分析图
哈尔滨工业大学理学硕士学位论文-31-3.3C1orf109蛋白经蛋白酶体途径降解3.3.1C1orf109-265蛋白经蛋白酶体途径降解在了解C1orf109蛋白两个蛋白质在细胞中的半衰期基础上，为了探究C1orf109-265蛋白在细胞内的降解途径，本研究使用MG132来处理细胞。MG132是一种常用的蛋白酶体抑制剂，可以抑制通过蛋白酶体途径降解的蛋白质发生降解。在六孔板HeLa细胞中转染2μg的pCMV-Flag-C1orf109-265质粒，转染6h后对细胞进行换液；转染24h后，对细胞进行MG132加药处理，将MG132储存液稀释到DMEM培养基中，使其终浓度为10μM，使用含有MG132的DMEM培养基给细胞换液，继续培养；在加入MG132处理0h，0.5h，1h，2h，3h和4h时，分别收取细胞，加入100μL裂解液提取总蛋白，以β-actin蛋白作为内参，利用蛋白质免疫印迹技术检测C1orf109蛋白表达水平变化。实验结果如图3-3所示，从图中可以看出，C1orf109-265蛋白在加入MG132处理后，蛋白表达量逐渐上升，在MG132作用4h后，C1orf109-265蛋白发生了明显的积累，说明C1orf109-265蛋白可以通过泛素-蛋白酶体途径发生降解。图3-3HeLa细胞中不同MG-132作用时间对C1orf109-265蛋白水平影响a)C1orf109-265蛋白表达量检测b)C1orf109-265蛋白表达量灰度分析图为了探究C1orf109-265蛋白在不同细胞中的降解途径，我们在HEK-293T细胞中进行了相同的实验检测分析。如图3-4所示，我们得到了相同的结果，在使用MG132处理细胞后，C1orf109-265蛋白表达水平逐渐上升，MG132作用4h后，C1orf109-265蛋白发生了明显的积累，说明C1orf109-265蛋白可以通过泛素-蛋白酶体途径发生降解。
本文编号：3116615
【文章来源】：哈尔滨工业大学黑龙江省 211工程院校 985工程院校
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【学位级别】：硕士
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HeLa细胞中C1orf109-265/280蛋白半衰期分析
哈尔滨工业大学理学硕士学位论文-30-3.2.2HEK-293T细胞中C1orf109蛋白半衰期检测为了进一步确认C1orf109蛋白在不同细胞中的半衰期是否存在差异或是相似，我们又将pCMV-Flag-C1orf109-265和pCMV-Flag-C1orf109-280两种表达质粒瞬时转染到HEK-293T细胞中，同样地，在转染24h后，将细胞换液为含有100μg/mL放线菌酮的DMEM培养基，在加入放线菌酮处理0h，0.5h，1h，2h，3h和4h时，分别收取细胞，加入100μL裂解液提取总蛋白，以β-actin蛋白作为内参，利用蛋白质免疫印迹技术检测C1orf109蛋白表达水平变化。实验结果如图3-2所示，从图中可以看出，与在HeLa细胞中相似，C1orf109-265蛋白和C1orf109-280蛋白在加入放线菌酮处理后，蛋白表达量逐渐下降，在4h时，两者表达量均接近于零，C1orf109-265蛋白的半衰期在2h-3h之间，C1orf109-280蛋白半衰期1h左右；对比来看，在HEK-293T细胞中，C1orf109-265蛋白比C1orf109-280蛋白半衰期长，较为稳定。图3-2HEK-293T细胞中C1orf109-265/280的半衰期分析a)C1orf109-265蛋白半衰期检测b)C1orf109-280蛋白半衰期检测c)C1orf109-265/280蛋白半衰期检测灰度分析图
哈尔滨工业大学理学硕士学位论文-31-3.3C1orf109蛋白经蛋白酶体途径降解3.3.1C1orf109-265蛋白经蛋白酶体途径降解在了解C1orf109蛋白两个蛋白质在细胞中的半衰期基础上，为了探究C1orf109-265蛋白在细胞内的降解途径，本研究使用MG132来处理细胞。MG132是一种常用的蛋白酶体抑制剂，可以抑制通过蛋白酶体途径降解的蛋白质发生降解。在六孔板HeLa细胞中转染2μg的pCMV-Flag-C1orf109-265质粒，转染6h后对细胞进行换液；转染24h后，对细胞进行MG132加药处理，将MG132储存液稀释到DMEM培养基中，使其终浓度为10μM，使用含有MG132的DMEM培养基给细胞换液，继续培养；在加入MG132处理0h，0.5h，1h，2h，3h和4h时，分别收取细胞，加入100μL裂解液提取总蛋白，以β-actin蛋白作为内参，利用蛋白质免疫印迹技术检测C1orf109蛋白表达水平变化。实验结果如图3-3所示，从图中可以看出，C1orf109-265蛋白在加入MG132处理后，蛋白表达量逐渐上升，在MG132作用4h后，C1orf109-265蛋白发生了明显的积累，说明C1orf109-265蛋白可以通过泛素-蛋白酶体途径发生降解。图3-3HeLa细胞中不同MG-132作用时间对C1orf109-265蛋白水平影响a)C1orf109-265蛋白表达量检测b)C1orf109-265蛋白表达量灰度分析图为了探究C1orf109-265蛋白在不同细胞中的降解途径，我们在HEK-293T细胞中进行了相同的实验检测分析。如图3-4所示，我们得到了相同的结果，在使用MG132处理细胞后，C1orf109-265蛋白表达水平逐渐上升，MG132作用4h后，C1orf109-265蛋白发生了明显的积累，说明C1orf109-265蛋白可以通过泛素-蛋白酶体途径发生降解。
本文编号：3116615
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