壳斗科植物叶片高纯度基因组DNA提取方法的优化

发布时间：2021-04-03 22:49

　　壳斗科植物叶片富含色素、多糖及多酚类等物质,采用常规CTAB法、SDS法虽然总DNA产率较高,但多酚类和多糖污染严重;采用进口试剂盒提取,虽能有效降低总DNA中多糖多酚类物质的污染,但DNA产率低,常伴有明显降解,不能满足测序要求,性价比差。因此,现有的DNA提取方法难以满足二代测序酶切法建库对DNA纯度和产量的要求。通过对4种CTAB提取方法进行对比和改良,结合硅胶吸附法,对6种壳斗科植物叶片总DNA抽提进行测试和优化,对比不同方法所获DNA产率、纯度差异和对下游分子生物学实验的影响。结果表明,常规CTAB法和Rezadoost改良法所获DNA产率高,但多糖污染严重。Sahu改良法所获DNA纯度最高,除糖除酚效果最好,但产率损失最高。而本实验室的改良CTAB法,在细胞核裂解之前,加入含有抗坏血酸、Triton X-100等的漂洗液,有效去除多糖多酚等杂质,所提取的DNA纯度高,产率大,相比核裂解之后进行除杂的效果更优,最适于后期分子实验的应用。进一步采用硅胶吸附可有效纯化并获得高纯度DNA,能满足下游PCR及酶切实验。该方法能有效克服传统CTAB法和试剂盒在壳斗科植物提取中的困难。 

【文章来源】：分子植物育种. 2020,18(20)北大核心CSCD

【文章页数】：9 页

【部分图文】：

4种方法提取的基因组DNA的电泳图谱

壳斗科植物叶片含有较多的多糖多酚类次生代谢物(周磊等,2012)，要获取高质量DNA较困难，并且多糖会与DNA共沉淀形成复合物，在提取时难以去除。本研究通过4种方法分别对硅胶干燥样与鲜样进行了DNA提取比较，结果表明4种方法得到的DNA质量与产率有所不同，其中常规CTAB法和Rezadoost改良法得到的DNA产率较大，但其质量纯度也较差。上述两种方法都采用粗提DNA后，加入高盐去除多糖，利用高盐在乙醇或异丙醇条件下，DNA会优先沉淀，从而分离多糖。然而对于多糖含量非常高的材料，多糖会随DNA共沉淀(Porebski et al.,1997)。在提取过程中，我们观察到这两种方法提取的DNA沉淀呈团状，粘稠且难以溶解，甚至在琼脂糖凝胶电泳时，DNA中杂质过高，较粘稠，常飘出点样孔，或是富集于加样孔中，因此这些总DNA并不能直接用于后续的分子实验。但经过硅胶吸附纯化后，核酸电泳后的DNA条带亮而整齐，表明多糖污染是电泳条带变形的主要原因。图3 4种方法提取的总DNA进行PCR的对比

图2 硅胶悬浊液吸附纯化后的总DNA的电泳检测本研究改良CTAB法所提取的纯度与产量较好，利用多糖多酚等次生代谢物主要存在于细胞质中与DNA相互隔离这一性质，在裂解细胞核之前，利用漂洗液反复清洗，离心，将细胞质中的大多数多糖多酚与细胞核分离开，即可有效去除杂质，并且在漂洗液与裂解液中加入抗坏血酸、月桂酰基氨酸钠等表面活性剂可降低醌类物质的影响，有效防止多酚类物质被氧化。漂洗液中加入的Triton X-100表面去污剂，有助于蛋白质与DNA的分离，并且能有效去除色素污染，从而获取较高质量的基因组DNA。由于多糖会随DNA共沉淀，因此本方法比起普通的CTAB法在裂解DNA后再除杂的效果更加显著。而Sahu改良法主要通过在细胞提取液中加入蔗糖，60℃水浴，调节提取液的渗透压，使细胞核内渗透压保持平衡，结合一定的转速离心，从而分离不同密度的内容物，以此获得高质量的DNA。虽然这种方法所得到的DNA产量有较大的损失，但也可直接用于后续的分子实验，避免了因纯化带来产量的再次损失。而对产量要求较高的分子实验，也可通过此方法提取多管DNA，然后以合并的方法解决。结合4种方法提取的DNA的产率和纯度来看，改良CTAB法比其他方法更具优势，更适于直接用于后续的分子实验。

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3117229