胞浆接头蛋白Dok5的表达及生物信息学分析

发布时间：2021-04-18 16:59

　　[目的]构建携带小鼠Dok5基因及其PH、PTB结构域的原核表达载体,并表达对应GST融合蛋白。[方法]从小鼠脑组织提取总RNA,逆转录后经PCR扩增、酶切、连接及转化大肠杆菌DH5α,构建携带Dok5全长（FL）、PTB、PH结构域的原核表达质粒,经酶切及测序鉴定之后,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达蛋白,再利用Glutathion Sepharose 4B亲和层析柱纯化得到融合蛋白,并通过Western Blotting检测其与相应抗体的反应性。利用生物信息学相关软件（ClustalW2、ProtParam、ProtScale、NetPhos 2.0 Server、SOPMA、Swissmodel）预测Dok5蛋白的理化性质和磷酸化位点以及二、三级结构。[结果]构建了小鼠Dok5 FL、PH、PTB的原核表达质粒,并得到了浓度分别为0.3 mg/ml、0.6 mg/mL、1 mg/mL的pGEX 6p-1-Dok5 FL、PH、PTB蛋白,其中Dok5 FL融合蛋白与相应抗体具有良好的反应性。Dok5长度为921 bp,编码306个氨基酸,在人、鼠、猴中高度保守。Dok5相... 

【文章来源】：生物技术. 2020,30(02)

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【部分图文】：

p GEX6p-1 Dok5质粒的构建及鉴定

Dok5是作为受体型酪氨酸蛋白激酶c-Ret的底物而被发现的，它与c-Ret在多种神经组织中共表达，介导神经元的分化[8]。在结构上，Cai D等对Dok5氨基酸序列的分析发现Dok5与胰岛素受体底物结构相似，都具有PH-PTB Domain，因此将其命名为IRS6[17]。蛋白的结构域是其发挥生物学功能的关键。Dok蛋白的三个结构域中，PH结构域可与磷脂酰肌醇结合，介导与胞膜的相互作用，在靶向质膜的过程中至关重要[18]。PTB域是蛋白有选择性地结合RTK的重要结构[19],C末端是Dok下游信号蛋白结合的区域。其中，Dok5的PTB结构域更受关注。Shi L等通过酵母双杂交实验证明，Dok5可以通过其PTB结构域，以激酶活性依赖的方式与Trk受体NPQY基序结合，并且与N-shc竞争结合同一位点[11]。阎志勇等利用pGEX4T-3原核表达系统纯化得到了Dok5 PTB结构域的融合蛋白[20]。本研究与其方法相似，所用表达载体为p GEX6p-1，同样获得了Dok5 PTB蛋白，并且同时得到了Dok5全长和PH结构域蛋白。石宁等通过X晶体衍射分析了其晶体结构，发现Dok5 PTB结构域的晶体结构与胰岛素受体底物(IRS1)很相似，都是由一个紧密的7β片层三明治和一个C末端的长α螺旋组成，该结构是PTB结构域识别底物的结构基础[15]。其对Dok5PTB结构域的研究更为深入，晶体结构虽然不能代表蛋白在生理条件下的天然结构，但是对Dok5蛋白结构的解析依然具有重要指示意义。Dok5 C端也具有多个酪氨酸磷酸化位点，目前尚不清楚Dok5 C端在介导的信号传递中的作用机制。由于C端富含疏水性氨基酸，在BL21中不易正确折叠，导致形成包涵体结构，难以获得C端的融合蛋白，这也是本研究的不足之处。潘艳芳等比对了人和小鼠的Dok5氨基酸序列，发现其高度相似[12]，本研究增加了恒河猴氨基酸序列的比对，一致性达到了99.35%。其中，PTB结构域氨基酸序列完全一致，提示PTB域在细胞信号转导过程中可能通过相似的方式传递信号。相对而言，C端的差异较大，人和猴的C端有1个氨基酸的差异，和小鼠共有5个氨基酸不同，提示C端在下游信号传递中可能采用不同的模式，并与氨基酸位点的磷酸化相关。目前，Dok5的功能和发挥功能的机制还不清楚，需要进一步研究。图3 Dok5 FL/PH/PTB融合蛋白在BL21中的溶解性分析和纯化鉴定

Dok5 FL/PH/PTB融合蛋白在BL21中的溶解性分析和纯化鉴定

【参考文献】：
期刊论文
[1]Dok5基因3’非编码区（3’UTR）的多态性与我国汉族2型糖尿病关系的初步研究[J]. 刘雪梅,朱丽媛,安芳,朱惠娟,彭小忠,潘慧.  中国卫生检验杂志. 2014(14)
[2]Dok4和Dok5 PTB结构域融合蛋白的表达和纯化[J]. 阎志勇,吴爱群,张勇,由振东,路长林,周明明,何成.  河南医学研究. 2003(02)

博士论文
[1]神经元分化相关蛋白Dok5和MAP1B的功能研究[D]. 花芳.中国协和医科大学 2005
[2]两种DOK蛋白PTB结构域晶体结构及其相关功能的研究[D]. 石宁.中国协和医科大学 2003

硕士论文
[1]Dok5促进GDNF诱导PC12-GFRa1-RET细胞分化[D]. 仇海燕.青岛大学 2004



本文编号：3145837