利用杆状病毒表达系统生产重组蛋白的工艺优化

发布时间：2021-05-10 12:39

　　杆状病毒表达系统（Baculovirus expression vector system,BEVS）是目前最具应用价值的商业化表达系统之一。昆虫细胞作为其中重要组成之一,已有两个应用最广泛的商业化细胞系,草地贪纹夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢细胞系Sf9和粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）胚胎细胞系BTI-Tn-5Bl-4（High Five）。虽然昆虫细胞的悬浮培养技术已经比较完善,但是利用BEVS进行外源蛋白重组表达过程中仍然存在细胞活力低、细胞增殖不稳定以及细胞衰退等问题,对后续重组杆状病毒制备和外源蛋白表达非常不利。本课题从昆虫细胞摇瓶培养出发,对细胞培养及重组杆状病毒制备的基本工艺进行了优化,并在此基础上建立了人源甲状腺过氧化物酶（Human throid peroxidase,hTPO）和禽腺病毒纤维蛋白2（Fiber-2）的表达工艺,为优化基于杆状病毒表达系统的重组蛋白生产工艺提供了技术支撑。首先,在100 ml摇瓶中进行Sf9和High Five细胞的悬浮培养工艺优化,从常用的商业化培养基中筛选出最适培养基IB-905。在此培养基中,确... 

【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
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第1章 文献综述
    1.1 昆虫细胞培养
        1.1.1 昆虫细胞系
        1.1.2 昆虫细胞培养基
        1.1.3 昆虫细胞悬浮培养技术
    1.2 杆状病毒
        1.2.1 杆状病毒分类
        1.2.2 杆状病毒感染宿主机制
    1.3 杆状病毒表达系统及其应用
        1.3.1 杆状病毒表达系统
        1.3.2 杆状病毒表达系统发展
        1.3.3 杆状病毒表达系统应用
    1.4 本课题研究的内容和意义
第2章 昆虫细胞培养工艺优化
    2.1 实验材料
    2.2 实验方法
        2.2.1 Sf9和High Five细胞液体培养基配制
        2.2.2 昆虫细胞冻存和复苏
        2.2.3 昆虫细胞计数
        2.2.4 昆虫细胞的生长曲线绘制
        2.2.5 昆虫细胞培养基筛选
        2.2.6 昆虫细胞传代密度筛选
        2.2.7 昆虫细胞摇瓶培养的溶解氧优化
        2.2.8 血清添加对细胞生长的影响
    2.3 实验结果
        2.3.1 商业化无血清培养基筛选
        2.3.2 传代密度对昆虫细胞生长的影响
        2.3.3 溶解氧对昆虫细胞生长的影响
        2.3.4 血清添加对细胞生长及存活率的影响
    2.4 讨论
    2.5 小结
第3章 重组杆状病毒生产工艺优化
    3.1 实验材料
    3.2 实验方法
        3.2.1 菌种保藏
        3.2.2 重组杆状病毒转移载体MultiBac-hTPO构建
        3.2.3 重组杆状病毒的制备
        3.2.4 重组杆状病毒增殖方式优化
        3.2.5 重组杆状病毒保存条件优化
    3.3 实验结果
        3.3.1 重组杆状病毒转移载体MultiBac-hTPO验证
        3.3.2 收获重组杆状病毒MultiBac-hTPO
        3.3.3 细胞培养方式对病毒出芽增殖的影响
        3.3.4 重组杆状病毒保存条件对病毒滴度的影响
    3.4 讨论
    3.5 小结
第4章 基于BEVS的分泌型蛋白表达工艺优化
    4.1 实验材料
    4.2 实验方法
        4.2.1 hTPO表达测试
        4.2.2 hTPO表达的感染复数和感染时间的优化
        4.2.3 hTPO在High Five细胞中表达的细胞感染密度优化
        4.2.4 hTPO亲和纯化及反应原性检测
    4.3 实验结果
        4.3.1 hTPO在Sf9和High Five两种细胞中表达验证
        4.3.2 hTPO在两种细胞中表达的感染复数和感染时间优化
        4.3.3 hTPO在High Five细胞中表达的细胞感染密度优化
        4.3.4 hTPO亲和纯化及反应原性检测
    4.4 讨论
    4.5 小结
第5章 基于BEVS的胞内蛋白表达工艺优化
    5.1 实验材料
    5.2 实验方法
        5.2.1 重组杆状病毒转移载体MultiBac-Fiber-2构建及重组病毒制备
        5.2.2 Fiber-2蛋白表达及检测
        5.2.3 Fiber-2蛋白表达条件优化
        5.2.4 Fiber-2重组蛋白生产及反应原性检测
    5.3 实验结果
        5.3.1 重组杆状病毒转移载体MultiBac-Fiber-2验证及重组病毒获得
        5.3.2 Fiber-2在Sf9和High Five两种细胞中的表达
        5.3.3 Fiber-2在两种细胞中表达的MOI和感染时间优化
        5.3.4 High Five细胞表达Fiber-2细胞感染密度优化
        5.3.5 Fiber-2蛋白反应原性及效价测定
    5.4 讨论
    5.5 小结
第6章 总结与展望
    6.1 总结
    6.2 展望
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Sf9昆虫细胞悬浮培养工艺研究[J]. 李伟,秦红刚,张萍,漆世华,朱薇,王威,谢红玲,温文生,吴玉石.  中国兽药杂志. 2012(08)
[2]昆虫杆状病毒杀虫剂的研究进展[J]. 李颖,孙兴鲁,浦冠勤.  中国蚕业. 2010(04)
[3]昆虫细胞系的培养和建立技术[J]. 张寰,张永安,秦启联,王玉珠,曲良建,李瑄,苗麟,殷珍仙,张爱君,温发园.  昆虫学报. 2007(08)
[4]葡萄糖的添加对昆虫细胞Sf21悬浮生长的影响[J]. 李文青,肖成祖,黄子才,陈昭烈.  生物工程学报. 1996(01)



本文编号：3179380