Pyrococcus furiosus超高温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的表达研究

发布时间：2021-06-05 06:40

　　α-淀粉酶又称淀粉-1,4-糊精酶,也命名为α-1,4-D-葡聚糖-葡萄糖苷水解酶,其作用于淀粉时,可以从淀粉、多聚糖或寡聚糖分子内部随机地切开α-1,4-葡萄糖苷键,产生葡萄糖、麦芽糖和低聚糖等。α-淀粉酶在食品、药品、纺织、造纸等工业领域广泛应用。超高温α-淀粉酶是指最适温度在90℃以上的α-淀粉酶,它具有更优越的的酶学特性,使得它更适用于淀粉的喷射液化工艺,提高淀粉加工生产效率,降低生产成本。枯草芽孢杆菌是一类革兰氏阳性杆状好氧型细菌,也是芽孢杆菌中的模式生物,被美国食品药物管理局（FDA）和中国农业部等部门批准为食品安全微生物（GRAS）。因此,利用枯草芽孢杆菌表达系统来生产酶制剂在工业上具有很大的价值。实验室前期对枯草芽孢杆菌表达系统有一定研究和改造,现拥有良好的枯草芽孢杆菌表达宿主。本研究将来源于极端嗜热古菌Pyrococcus furiosus的超高温α-淀粉酶（PFA）基因在Bacillus subtilis中表达,并测定重组超高温α-淀粉酶的酶学性质。通过信号肽筛选、伴侣蛋白共表达和热处理等方式,有效提高PFA在枯草芽孢杆菌中重组表达的胞外酶活。最后在在摇瓶基础上,对... 

【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

重组质粒pHY300PLK-pfa的构建Fig.3-1ConstructionofrecombinantplasmidpHY300PLK-pfa根据In-FusionHDCloningKit试剂盒要求，将基因片段与载体片段按照摩尔比

江南大学硕士学位论文24图3-2重组质粒pHY300PLK-pfa的HindIII酶切验证;M：10000bp标准核酸分子量；1：质粒酶切样品Fig.3-2HindIIIdigestionofrecombinantplasmidpHY300PLK-pfaM:10000bpMaker;1:plasmiddigestedsample利用枯草芽孢杆菌化学转化方法，将重组质粒pHY300PLK-pfa转化到感受态宿主菌B.subtilisWS9中，然后涂布到四环素抗性(20μg·mL-1)的液体固体LB培养基上，37℃培养10h。挑阳性单克隆到液体LB培养基中，培养10h后按照2.5%的接种量转接到TB培养基中，相同条件继续发酵培养60h。发酵结束后离心取上清，并用去离子水稀释OD600为5的菌体，随后在超声破碎仪中进行破碎，离心取破壁上清。测定胞外胞内酶活，其中胞外酶活为18.33U·mL-1，胞内酶活为11.9U·mL-1。3.1.2重组超高温α-淀粉酶酶学性质为了更全面地了解来源于嗜热古菌P.furiosus在枯草芽孢杆菌中表达的重组超高温α-淀粉酶的相关特征，对该酶的酶学性质进行了初步探究，探究了重组酶的最适温度、温度稳定性、最适pH、pH稳定性等相关信息，为其在应用方面提供参考。3.1.2.1重组超高温α-淀粉酶最适温度为了测定重组超高温α-淀粉酶的最适温度，要控制其它条件不变。实验选择pH为5.0的柠檬酸缓冲液，在不同的温度条件下(40～100℃)测定重组超高温α-淀粉酶的酶活。以最高酶活为100%，计算不同温度下的相对酶活。测定结果如图3-3。由图可知重组酶的最适温度为100℃，随着温度的降低酶活持续降低，70℃时该重组酶只有53.39%的相对酶活，到40℃时该重组酶仅有7.1%的酶活力。

江南大学硕士学位论文28图3-7信号肽筛选质粒pBES-sp-pfa的构建Fig.3-7ConstructionofsignalpeptidescreeningplasmidpBES-sp-pfa目的基因与筛选载体构建的重组筛选质粒，采用NdeI和EcoRI双酶切验证，酶切结果如图3-8。图3-8重组质粒pBES-pfa双酶切验证。M：10000bp标准核酸分子量；1：质粒酶切样品Fig.3-8RecombinantplasmidpBES-pfadoublerestrictiondigestionverification.M:10000bpMaker;1:plasmiddigestedsample经酶切验证和测序正确后，替换筛选载体上的信号肽，构建信号肽筛选文库。以重组筛选载体为模板，PCR扩增不含信号肽的载体片段，胶回收后与枯草芽孢杆菌173种混合的SPDNAmixture进行随机无缝链接，连接产物转化E.coliJM109，涂布于含有氨苄抗性(100μg·mL-1)的LB平板固体培养基中37℃过夜培养，随机挑取3-5个单克隆于LB液体培养基中过夜培养，次日收集菌体进行测序，验证质粒文库构建是否正确。测序结果显示这几个单克隆信号肽存在差异，说明构建的质粒文库合理可用。如表3.3，

【参考文献】：
期刊论文
[1]极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达[J]. 袁林,曾静,郭建军,郭浩,杨罡,陈俊.  食品科学. 2018(18)
[2]介导新生肽链折叠的胞质分子伴侣结构、功能及作用机制研究进展[J]. 于志超,李艳妮,乔建军.  生物物理学报. 2014(03)
[3]枯草芽孢杆菌作为外源基因表达系统的研究进展[J]. 沈卫锋,牛宝龙,翁宏飚,何丽华,孟智启.  浙江农业学报. 2005(04)
[4]合成耐高温α-淀粉酶基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达[J]. 韦宇拓,汪嵘,杜丽琴,陆坚,黄鲲,黄日波.  中国生物工程杂志. 2005(01)
[5]枯草芽孢杆菌整合载体研究进展[J]. 邹立扣,王红宁,潘欣.  生物技术通讯. 2003(06)
[6]耐高温α-淀粉酶在酒精生产中的应用[J]. 马福强.  酿酒科技. 2001(03)
[7]分子伴侣蛋白结构与功能的研究进展[J]. 朱美财,刘成刚.  空军总医院学报. 1999(04)
[8]五种α─淀粉酶测活方法的比较研究[J]. 史永昶,姜涌明.  微生物学通报. 1996(06)
[9]α－淀粉酶的生产与应用[J]. 谷军.  生物技术. 1994(03)

博士论文
[1]枯草芽孢杆菌菌株改造、启动子优化和普鲁兰酶的高效制备研究[D]. 张康.江南大学 2018
[2]来源于极端嗜热古菌Pyrococcus furiosus分子伴侣蛋白功能及其应用性研究[D]. 彭帅英.华东理工大学 2017
[3]枯草芽孢杆菌中Sec分泌途径底物特性及非经典分泌途径的研究[D]. 王光强.江南大学 2013
[4]Pyrococcus furiosus a-淀粉酶基因在不同宿主中的表达[D]. 沈微.江南大学 2003

硕士论文
[1]来源于Pyrococcus furiosus极端嗜热α-淀粉酶的研究[D]. 王丽萨.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院） 2007



本文编号：3211647