重组粘质沙雷氏菌脂肪酶的制备及其在手性拆分中的应用
发布时间：2021-06-13 05:00
粘质沙雷氏菌脂肪酶作为一种重要的生物催化剂,已被广泛应用于催化水解、酯化等多种反应。它能高立体选择性水解拆分消旋体反式3-（4-甲氧苯基）缩水甘油酸甲酯（MPGM）制备（2R,3S）-（-）-3-（4-甲氧苯基）缩水甘油酸甲酯,即（-）-MPGM,后者是制备冠动脉血管舒张剂地尔硫卓的重要原料。本文对本研究所保藏的粘质沙雷氏菌（Seratiamarcescens）H30所产的脂肪酶进行了基因克隆、大肠杆菌重组表达、发酵优化和固定化,并利用获得的脂肪酶对手性醇进行拆分研究。利用PCR方法克隆了粘质沙雷氏菌H30的脂肪酶基因,并成功构建了pET28a-lipase、pET32a-lipase和pGEX-4T-1-lipase三种重组表达载体,用大肠杆菌BL21（DE3）作为宿主菌株进行表达,筛选出酶活力最高的重组菌株pET32a-lipase,在摇瓶中进行了脂肪酶可溶表达优化,优化后重组脂肪酶的最高酶活力为25000U/L。用凝血酶切除pET32a的N端Trx-tag后,所获得的最高酶活力为65000U/L。用乳糖代替IPTG作为诱导剂,对重组菌株表达目的蛋白进行了培养基组分和发酵条件的优化...
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．６氨基载体固定化酶原理??Ｆｉｇ．?１．６?Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ｏｎ?ａｍｉｎａｔｅｄ?ｓｕｐｐｏｒｔｓ??
表达质粒pETZ翻.图谱
图２．３质粒ｐ（；Ｆ．Ｘ－４Ｔ－ｌ图谱??Ｆｉｇ．?２．３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＧＥＸ－４Ｔ－ｌ??将测序正确的艰组表达载体ｐＥＴ２８ａ－／／）；＞ａｓｅ、ｐＥＴ３２ａ－／／＞ｏｓｅ和ｐＧＥＸ－４Ｔ－１?转化??ｃｏ／／．?ＢＬ２１?（ＤＥ３）感受态细胞，３７°Ｃ培养挑収生长较好的单菌落，接种予：３０ｍＬ含??抗十．素的ＬＢ液体培养基屮，３７°Ｃ振荡培养过夜，収过夜培养的菌液ｌｍＬ，接种个：１００ｍＬ??Ｉｔ走沾抗十：袭的ＬＢ液休培养堆中，３７°Ｃ＇、ＳＯＯｒｐｍ＾Ｋ：宁：ＯＤ位为０．６－０．８Ａ：“，加入??０．１％?（ｖ／ｖ）?１Ｍ的诱异剂ＩＰＴＧ」］０°Ｃ培养８ｈ后离心收災蘭体。将阐体取姑ｊ？２５ｍｌ?２５ｍＭ??Ｔｉ－ｉｓ－ｉｉａ（ｐｉｉ?８．〇）缓冲液中，超Ａ波破碎Ｉ則似適离心，对丨：仍ｙ沉淀??ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?分桁。??２．３．１０?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测丨丨的蛋ｆｔ??凝胶Ｆｉｔ！制：分离胶、浓缩胶的配制／／法见表２．５．??
【参考文献】：
期刊论文
[1]基因工程菌的高密度发酵研究[J]. 尹淑琴,范艳,常泓. 安徽农业科学. 2007(11)
本文编号：3227045
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．６氨基载体固定化酶原理??Ｆｉｇ．?１．６?Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ｏｎ?ａｍｉｎａｔｅｄ?ｓｕｐｐｏｒｔｓ??
表达质粒pETZ翻.图谱
图２．３质粒ｐ（；Ｆ．Ｘ－４Ｔ－ｌ图谱??Ｆｉｇ．?２．３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＧＥＸ－４Ｔ－ｌ??将测序正确的艰组表达载体ｐＥＴ２８ａ－／／）；＞ａｓｅ、ｐＥＴ３２ａ－／／＞ｏｓｅ和ｐＧＥＸ－４Ｔ－１?转化??ｃｏ／／．?ＢＬ２１?（ＤＥ３）感受态细胞，３７°Ｃ培养挑収生长较好的单菌落，接种予：３０ｍＬ含??抗十．素的ＬＢ液体培养基屮，３７°Ｃ振荡培养过夜，収过夜培养的菌液ｌｍＬ，接种个：１００ｍＬ??Ｉｔ走沾抗十：袭的ＬＢ液休培养堆中，３７°Ｃ＇、ＳＯＯｒｐｍ＾Ｋ：宁：ＯＤ位为０．６－０．８Ａ：“，加入??０．１％?（ｖ／ｖ）?１Ｍ的诱异剂ＩＰＴＧ」］０°Ｃ培养８ｈ后离心收災蘭体。将阐体取姑ｊ？２５ｍｌ?２５ｍＭ??Ｔｉ－ｉｓ－ｉｉａ（ｐｉｉ?８．〇）缓冲液中，超Ａ波破碎Ｉ則似適离心，对丨：仍ｙ沉淀??ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?分桁。??２．３．１０?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测丨丨的蛋ｆｔ??凝胶Ｆｉｔ！制：分离胶、浓缩胶的配制／／法见表２．５．??
【参考文献】：
期刊论文
[1]基因工程菌的高密度发酵研究[J]. 尹淑琴,范艳,常泓. 安徽农业科学. 2007(11)
本文编号：3227045
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3227045.html
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