植烷醇磷酸甘露糖的酶法合成及应用

发布时间：2021-06-25 23:41

　　内质网（ER）腔内的甘露糖基化修饰共同存在于N-糖基化、糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定化、O-和C-甘露糖基化中,对于真核生物来说具有重要的作用。ER腔内的甘露糖基化的底物供体为多萜醇磷酸甘露糖（Dol-P-Man）,因此Dol-P-Man的合成对于理解不同种类的糖基化修饰具有重要的意义。本研究原核表达纯化了酵母Dol-P-Man的合成酶（Dpm1）,并鉴定了重要的DXD motif。利用纯化的Dpm1蛋白,及简单的植烷醇（Phytanol）代替复杂的多萜醇（Dolichol）,体外酶法合成了Dol-P-Man的替代结构Phy-P-Man。在N-糖基化途径中Alg3催化Dol-PPGlcNAc2-Man5和Dol-P-Man生成Dol-PP-GlcNAc2-Man6。通过体外酶反应,本研究证明PhyP-Man同样能够作为Alg3的底物供体用于N-糖基化途径的研究,为以后合成高甘露糖型的N糖结构及GPI、O-和C-甘露糖基化的研究奠定了基础。 

【文章来源】：食品与生物技术学报. 2020,39(03)北大核心CSCD

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

酵母重组蛋白M-Alg3的原核表达Western blotting图

接下来，利用含有重组蛋白M-Alg3的大肠杆菌膜成份催化Phy-PP-M5与Phy-P-Man，反应结束后酸解去掉脂肪链部分，纯化糖链后LC-MS分析结果。如图6(a）所示，与空载大肠杆菌膜成份比较，含有重组蛋白M-Alg3的大肠杆菌膜成份催化后多了一组峰。ESI-MS确证了2组峰分别起源于底物Phy-PP-M5(14.6,14.8）和产物Phy-PP-M6(15.4,15.5）（图6(b））。综上证明Phy-P-Man能够被Alg3所催化应用到N-糖基化途径研究。3 结语

基于多萜醇磷酸甘露糖（Dol-P-Man）在ER糖基化4种修饰中的重要作用，本研究将利用酵母Dpm1进行酶法合成，并采用结构简单的Phytano（含有20个碳），替代Dolichol（含有100个碳以上）（图1）。首先构建了原核表达质粒pET28a-Dpm1，转入Rosetta DE3）大肠杆菌中，低温过夜诱导。诱导菌体破碎提取细胞膜成份，溶解于去污剂Triton X-100，利用镍亲和层析纯化。对500 mmol/L咪唑洗脱液SDS-PAGE分析，结果如图2(a）显示3×104左右，有一条明显的条带，与Dpm1预期的大小相一致，成功实现了Dpm1的纯化。接下来，利用纯化的Dpm1催化Phy-P与GDP-Man形成Phy-P-Man。如图2(b)的TLC结果所示，底物Phy-P的比移值（Rf）为0.64（条带1），在加入Dpm1后Rf变为0.58（条带2）。Rf的降低是由于亲水性的Man基团加入到底物中形成了产物Phy-P-Man导致极性变大，从而在展开剂中迁移率变慢。此结果说明原核表达纯化的Dpm1活性很高，能完全催化Phy-P生成Phy-P-


本文编号：3250180