内含子编码蛋白Mg 2+ 结合位点功能分析及验证

发布时间：2021-06-28 16:36

　　旨为筛选并构建II型内含子编码蛋白Mg²⁺结合位点突变体,验证该位点突变对II型内含子"归巢"效率的影响。利用生物信息学技术筛选关键位点,利用定点突变技术构建突变体,利用Targetron及蓝白斑计数法验证其"归巢"效率。结果显示,筛选到D308和D309两个位点是II型内含子编码蛋白Mg²⁺结合的核心催化位点,并成功构建该位点的三种突变体,包括两个单点突变体（D308A和D309A）和一个双点突变体（D308A/D309A）,大肠杆菌体内实验结果表明,三种突变体均完全失活了II型内含子的"归巢"功能。证实了II型内含子编码蛋白Mg²⁺结合位点是其发挥功能的核心催化位点。 

【文章来源】：生物技术通报. 2020,36(10)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

II型内含子“归巢”示意图

为了验证D308A、D309A、D308A/D309A突变对II型内含子“归巢”效率的影响,将突变型IEP蛋白取代Targetron载体上的野生型IEP蛋白,构建Mg2+结合位点突变的Targetron载体,同时以野生型Targetron载体作为对照,分别转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后涂布含有Xgal和IPTG的平板,过夜培养后通过菌落PCR(图4)及蓝白斑筛选(图5-A),分析IEP蛋白Mg2+结合位点突变对Ⅱ型内含子“归巢”效率的影响。研究结果表明,野生型Ⅱ型内含子在大肠杆菌中针对lacZ-635s位点的“归巢”效率为90.845%±6.792%,针对lacZ-1063a位点的“归巢”效率为92.582%±2.898%[24];然而,将IEP蛋白反转录结构域Mg2+结合位点(D308A、D309A、D308A/D309A)突变后,平板均为蓝斑,菌落PCR验证其靶位点也没有任何内含子插入,其“归巢”效率均降低为0%(图4-5)。此结果表明,IEP蛋白反转录结构域Mg2+结合位点突变,失活了IEP蛋白的反转录功能,使Ⅱ型内含子不能以内含子RNA为模板合成cDNA而插入到DNA靶位点,即II型内含子完全失去其“归巢”功能。图3 IEP蛋白生物信息学分析

IEP蛋白生物信息学分析

【参考文献】：
期刊论文
[1]L1.LtrB内含子编码蛋白反转录结构域关键催化位点分析及功能验证[J]. 陈相好,张峥嵘,刘芳,陈峥宏,洪伟,綦廷娜,谷俊莹,崔古贞.  微生物学报. 2019(12)
[2]高效严谨型大肠杆菌Targetron基因打靶系统的构建[J]. 陈相好,刘芳,王彩霞,陈峥宏,洪伟,蔡梦迪,张峥嵘,綦廷娜,廖永慧,谷俊莹,崔古贞.  生物技术通报. 2019(06)



本文编号：3254672