水稻细胞分裂素氧化/脱氢酶（OsCKXs）基因家族成员定向突变体库构建及分析
发布时间：2021-06-28 19:21
水稻既是重要的粮食作物也是单子叶植物生物学研究的模式材料,随着水稻功能基因组学研究的深入及分子操作技术的成熟,有效解读水稻内源基因生物功能,进而进行有效的分子育种日益成为可能。细胞分裂素（cytokinin,CTK）是植物生长发育过程必不可少的激素成分,细胞分裂素氧化/脱氢酶（cytokinin oxidases/dehydrogenase,CKX）通过降解细胞分裂素,有效调控植物内源细胞分裂素水平,是细胞分裂素信号通路中降解分支的关键酶。水稻全基因组中注释了11个CKX基因,已有研究揭示了其中部分基因对水稻生长的调控作用,但因为缺乏明确的突变体材料,水稻OsCKX基因家族具体成员的生物功能所至有限。本文应用CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a基因组编辑技术,以日本晴为模式材料,针对OsCKX基因家族成员进行定向敲除,创制OsCKX1OsCKX11单基因及多基因定向敲除突变体材料,为系统研究OsCKX基因家族不同成员生物功能及有效进行分子育种奠定基础。本文主要研究内容及结果如下:1.基于CRISPR-Cas9核酸酶编辑系统向导RNA（single g...
【文章来源】：电子科技大学四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
OsCKXs基因家族定向敲除靶位点设计示意图
基于 CRISPR-Cas9 基因编辑的特点，本实验针对 OsCKX1~OsCKX11 各个基因分别设计两个目标基因靶位点，确保获得足够数目的理想突变体材料。CRISPR-Cas9 单基因定向敲除载体构建完成后通过根癌农杆菌介导的水稻稳定转化获得再生植株，利用 PCR-SSCP、PCR-RFLP 技术对再生植株进行检测并统计突变效率。从各个基因的中分别选择两个突变植株确定其基因型并种植收获后代。3.2.1 CRISPR-Cas9 双 sgRNA 定向敲除载体设计及构建3.2.1.1 载体设计本实验基于骨架载体 pZHY988，针对 OsCKX1~OsCKX11 设计双位点靶向单基因的敲除载体。通过 PCR 反应扩增获得插入片段，包括酶切保护碱基和酶切位点、sgRNA1 及其 gRNAscaffold 部分、sgRNA2 及其 U6 启动子。插入片段和骨架载体中均存在 BsaI 酶切位点，经 BsaI 酶酶切使骨架载体的 ccdB（致死基因）表达框缺失，取而代之为 T4 连接酶连入的 sgRNA 表达单元，完成载体构建。
第三章 结果与分析和下游引物，Cas9-Primer-F 和 Cas9-Primer-R 即（5’CATTGTGAATGTTTTGTTGGATC3’）和（5’TTCTAATAAACGCTCTTTTCTCT3’），正确构建载体则扩增片段大小为 951 bp，如图 3-3（d）。挑选检测正确的阳性单克隆扩大培养用于质粒提取，质粒送于生工生物技术有限公司测序验证，成功构建 11 个定向敲除载体 pWY05~pWY15。
本文编号：3254904
【文章来源】：电子科技大学四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
OsCKXs基因家族定向敲除靶位点设计示意图
基于 CRISPR-Cas9 基因编辑的特点，本实验针对 OsCKX1~OsCKX11 各个基因分别设计两个目标基因靶位点，确保获得足够数目的理想突变体材料。CRISPR-Cas9 单基因定向敲除载体构建完成后通过根癌农杆菌介导的水稻稳定转化获得再生植株，利用 PCR-SSCP、PCR-RFLP 技术对再生植株进行检测并统计突变效率。从各个基因的中分别选择两个突变植株确定其基因型并种植收获后代。3.2.1 CRISPR-Cas9 双 sgRNA 定向敲除载体设计及构建3.2.1.1 载体设计本实验基于骨架载体 pZHY988，针对 OsCKX1~OsCKX11 设计双位点靶向单基因的敲除载体。通过 PCR 反应扩增获得插入片段，包括酶切保护碱基和酶切位点、sgRNA1 及其 gRNAscaffold 部分、sgRNA2 及其 U6 启动子。插入片段和骨架载体中均存在 BsaI 酶切位点，经 BsaI 酶酶切使骨架载体的 ccdB（致死基因）表达框缺失，取而代之为 T4 连接酶连入的 sgRNA 表达单元，完成载体构建。
第三章 结果与分析和下游引物，Cas9-Primer-F 和 Cas9-Primer-R 即（5’CATTGTGAATGTTTTGTTGGATC3’）和（5’TTCTAATAAACGCTCTTTTCTCT3’），正确构建载体则扩增片段大小为 951 bp，如图 3-3（d）。挑选检测正确的阳性单克隆扩大培养用于质粒提取，质粒送于生工生物技术有限公司测序验证，成功构建 11 个定向敲除载体 pWY05~pWY15。
本文编号：3254904
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