赤霉菌毒素合成相关基因Tri8的功能研究

发布时间：2021-06-29 03:04

　　赤霉病（Fusarium Head Blight,简称FHB）是一种在全球范围内流行的植物病害,对小麦产量造成了巨大影响。赤霉病也会引起食品安全风险,因为致病的镰刀菌可以合成脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）及其衍生物3-Ac DON、15-Ac DON等毒素。Tir8是参与镰刀菌毒素合成的关键基因之一。不同类型Tri8蛋白可以催化不同的脱乙酰基位点,从而产生不同类型的DON毒素。比如亚洲镰刀菌株Fa1312编码的Tri8蛋白能够催化中间体3,15-di Ac DON在15位碳原子处脱乙酰基形成3-Ac DON;而禾谷镰刀菌Fg1230的Tri8蛋白则催化该中间体3位碳原子处脱乙酰基形成15-Ac DON。表达纯化Tri8蛋白,分析其结构及催化特征,将有利于其作用机制的阐明,有助于小麦赤霉病及其引起的粮食毒素污染问题的防控。本论文研究包括以下几个方面的工作:（一）建立了Tri8蛋白原核表达纯化体系。通过PCR扩增获得Tri8基因并构建原核表达载体,将其导入大肠杆菌ER2566进行诱导表达。为便于纯化,融合蛋白带有MBP和His-tag标签,利用直链淀粉柱亲和层析... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

不同化学型赤霉菌毒素的合成途径Figure1-1SyntheticrouteofdifferentchemotypeGibberellatoxin

西北农林科技大学硕士学位论文103-AcDON酶切的片段大小大约是515bp和540bp（刘杨杨等2018）。1.5本研究的意义和目的小麦镰刀菌毒素DON以其前体形式3,15-diAcDON分泌，在细胞外被Tri8所编码的脂酶活化，进而形成不同化学型的DON毒素，即不同菌株中的Tri8蛋白可以催化不同的脱乙酰化作用，产生不同类型的DON毒素（AlexanderNJ.etal.，2011）。本研究拟建立Tri8蛋白的原核表达纯化体系，为通过生物化学和结构生物学方法研究Tri8蛋白催化机制奠定基矗同时该研究拟通过基因敲除和基因过量表达分别获得Tri8基因敲除株系和同时含有两种类型Tri8基因的过表达株系。利用这两种株系可以进一步确证Tri8的生物学功能，而且利用它们可以制备毒素前体3,15-diAcDON和毒素DON，为后续Tri8蛋白催化动力学研究及DON毒素检测提供支持。1.6技术路线图图1-2技术路线图Figure1-2Technologyroadmap

第二章Tri8基因的原核表达19图2-1Tri8基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析泳道M为DNAladder;泳道1为Tri8基因扩增产物Figure2-1AnalysisoftheamplifiedproductofTri8byAgaroseGelelectrophoresisThelaneMis1kbDNAladder;Thelane1istheamplifiedproductofTri8.2.3.2Tri8基因原核表达载体构建XhoI、EcoRI双酶切Tri8基因扩增片段和原核表达载体pET-21aHMT，凝胶回收酶切产物并进行连接反应，随后转化克隆菌株DH5。挑取单克隆菌落，采用Tri8基因上下游引物（Tri8-F/Tri8-R）进行菌落PCR筛选，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2-2所示，出现了符合预期的1400bp左右条带。随后对重组的原核表达载体进行进一步酶切和测序验证，验证正确后的质粒保存备用。图2-1Tri8基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析泳道M为DNAladder;泳道1为Tri8基因扩增产物Figure2-1AnalysisoftheamplifiedproductofTri8byAgaroseGelelectrophoresisThelaneMis1kbDNAladder;Thelane1istheamplifiedproductofTri8.


本文编号：3255591