基因组编辑对酿酒酵母DNA的损伤作用及修复响应
发布时间：2021-07-06 14:25
【目的】为了研究基因组编辑工具CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1所产生的DNA双链断裂（DNA doublestrandbreak,DSB）对酿酒酵母DNA的损伤作用及修复响应情况,对比化学物质甲基磺酸甲酯（methyl methanesulfonate,MMS）对酿酒酵母基因组DNA的损伤和修复,阐明编辑细胞在细胞水平和转录水平上的变化。【方法】起始细胞分为两种情况,包括未进行细胞周期同步化和被α-因子同步化细胞周期至G0/G1期。检测CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1处理后编辑细胞的生长情况。利用流式细胞术检测编辑细胞的细胞周期延滞的情况。利用荧光定量PCR检测编辑细胞和MMS处理细胞后DNA损伤响应关键基因转录表达水平的变化情况。【结果】起始细胞无论是未同步化还是同步化,其生长均受到基因组编辑抑制,细胞存活率降低,细胞周期被滞留在G2/M期,而MMS处理导致细胞周期S期的滞留。此外,随编辑时间的延长,突变率增加,细胞存活率降低。CRISPR/Cpf1编辑细胞的突变率和存活率均低于CRISPR/Cas9,由此可见,CRISPR/Cpf1对细胞的损伤强度高于C...
【文章来源】：微生物学报. 2020,60(07)北大核心CSCD
【文章页数】：17 页
【部分图文】：
未同步化和α-因子同步化细胞的基因组编辑效果评价
携带编辑质粒和空质粒的菌株(表1)各挑取2个单菌落分别接种到10 mL含有20 g/L葡萄糖的SD-His-Ura液体培养基中，过夜培养。分成2份，其中一份利用α-因子进行细胞周期同步化处理。以初始OD600=0.4转接到20 mL含有20 g/L葡萄糖的SD-His-Ura中，摇瓶中加入5μg/mLα-因子，30°C、250 r/min诱导培养；另一份不经过细胞周期的同步化。然后，将经过细胞周期同步化的菌体和未经过细胞周期同步化的菌体各自以初始OD600=0.4分别转接到下列2种培养基中：(1)20 mL含有20 g/L半乳糖的SD-His液体培养基，诱导编辑；(2)20 mL含有20 g/L葡萄糖的SD-His-Ura液体培养基，作为未诱导编辑的阴性对照。每个菌株每个培养基条件设置两组生物学平行。在30°C、250 r/min条件下培养36 h，定期取样，测定OD600，绘制生长曲线。为了计算编辑后的存活率和突变率，按照上述同样的方法培养菌液，定期取样，10倍梯度稀释，分别涂布于含有20 g/L葡萄糖的SD-His-Ura平板和含有20 g/L葡萄糖以及0.15%5-FOA的SD-His平板上，30°C静止培养36 h，统计平板上的菌落数，按照图1所示，计算存活率和突变率，即细胞存活率是用半乳糖诱导编辑的细胞在SD-His平板上生长的单菌落数目除以葡萄糖未诱导编辑的细胞在SD-His-Ura平板上生长的单菌落数目；突变率是半乳糖诱导编辑的细胞在含有5-FOA的SD-His平板上生长的单菌落数目除以在SD-His平板上生长的单菌落数目。1.5 细胞周期检测
影响，我们对编辑细胞在生长过程中的存活率和突变率进行了检测。在起始细胞未进行细胞周期同步化的情况下，无论是CRISPR/Cas9还是CRISPR/Cpf1介导的编辑，随着编辑时间的延长，细胞存活率逐渐下降，分别从8 h时间点的33.1‰和20.5‰逐渐下降到36 h时间点的3.2‰和1.2‰，分别下降了10倍和17倍；而编辑突变率逐渐升高，即发生易错修复的细胞比例逐渐升高，分别从12 h时间点的1.9‰和0.1‰升高到36 h时间点的14.4‰和1.7‰，分别升高了8倍和17倍(图3-A)。而且CRISPR/Cpf1对细胞的损伤强度高于CRISPR/Cas9，因为在相同的编辑时间点，前者的细胞存活率和突变率均低于后者。在起始细胞被α-因子同步化细胞周期至G0/G1期的情况下，随着编辑时间的延长，细胞存活率和编辑突变率的降低和升高的变化趋势与在起始细胞未进行细胞周期同步化的情况下类似(图3-B)。CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1介导的编辑，其细胞存活率分别从8 h时间点的11.1‰和9.9‰逐渐下降到36 h时间点的4.2‰和0.8‰，分别下降了3倍和12倍；而编辑突变率分别从12 h时间点的0.74‰和0.09‰升高到36 h时间点的13.4‰和1.6‰，均约升高了18倍(图3-B)。与CRISPR/Cas9编辑相比，CRISPR/Cpf1编辑的细胞存活率和突变率均较低，表明细胞对CRISPR/Cpf1编辑产生的5′2–4-nt粘性末端DSB的易错修复能力可能低于对CRISPR/Cas9编辑产生的平末端或低频率的5′1-nt DSB的易错修复。另外，对于同一种编辑工具编辑相同的时间而言，经α-因子细胞周期同步化的细胞的存活率和突变率均低于未经同步化的细胞。NHEJ作为一种在细胞内自发进行的DSB修复途径，在整个细胞周期内都能发挥作用，且主要发生在G1期[26]，但是将细胞周期同步化至condition grown in glucose media(right panel);D:The maximum cell growth rate(μmax)of synchronized and unsynchronized cells.Cells were cultured with glucose(left panel,unediting)and galactose(right panel,editing).The parameter ofμmax was calculated corresponding to the fermentation profiles using Originlab?Origin 8.The strains were listed in Table 1.Data represent the mean and standard error of duplicate cultures at each condition.图3.未同步化和α-因子同步化细胞的基因组编辑效果评价
【参考文献】：
期刊论文
[1]酿酒酵母形态变化检验点的研究进展[J]. 祝嫦巍,史钧. 基因组学与应用生物学. 2016(05)
本文编号：3268411
【文章来源】：微生物学报. 2020,60(07)北大核心CSCD
【文章页数】：17 页
【部分图文】：
未同步化和α-因子同步化细胞的基因组编辑效果评价
携带编辑质粒和空质粒的菌株(表1)各挑取2个单菌落分别接种到10 mL含有20 g/L葡萄糖的SD-His-Ura液体培养基中，过夜培养。分成2份，其中一份利用α-因子进行细胞周期同步化处理。以初始OD600=0.4转接到20 mL含有20 g/L葡萄糖的SD-His-Ura中，摇瓶中加入5μg/mLα-因子，30°C、250 r/min诱导培养；另一份不经过细胞周期的同步化。然后，将经过细胞周期同步化的菌体和未经过细胞周期同步化的菌体各自以初始OD600=0.4分别转接到下列2种培养基中：(1)20 mL含有20 g/L半乳糖的SD-His液体培养基，诱导编辑；(2)20 mL含有20 g/L葡萄糖的SD-His-Ura液体培养基，作为未诱导编辑的阴性对照。每个菌株每个培养基条件设置两组生物学平行。在30°C、250 r/min条件下培养36 h，定期取样，测定OD600，绘制生长曲线。为了计算编辑后的存活率和突变率，按照上述同样的方法培养菌液，定期取样，10倍梯度稀释，分别涂布于含有20 g/L葡萄糖的SD-His-Ura平板和含有20 g/L葡萄糖以及0.15%5-FOA的SD-His平板上，30°C静止培养36 h，统计平板上的菌落数，按照图1所示，计算存活率和突变率，即细胞存活率是用半乳糖诱导编辑的细胞在SD-His平板上生长的单菌落数目除以葡萄糖未诱导编辑的细胞在SD-His-Ura平板上生长的单菌落数目；突变率是半乳糖诱导编辑的细胞在含有5-FOA的SD-His平板上生长的单菌落数目除以在SD-His平板上生长的单菌落数目。1.5 细胞周期检测
影响，我们对编辑细胞在生长过程中的存活率和突变率进行了检测。在起始细胞未进行细胞周期同步化的情况下，无论是CRISPR/Cas9还是CRISPR/Cpf1介导的编辑，随着编辑时间的延长，细胞存活率逐渐下降，分别从8 h时间点的33.1‰和20.5‰逐渐下降到36 h时间点的3.2‰和1.2‰，分别下降了10倍和17倍；而编辑突变率逐渐升高，即发生易错修复的细胞比例逐渐升高，分别从12 h时间点的1.9‰和0.1‰升高到36 h时间点的14.4‰和1.7‰，分别升高了8倍和17倍(图3-A)。而且CRISPR/Cpf1对细胞的损伤强度高于CRISPR/Cas9，因为在相同的编辑时间点，前者的细胞存活率和突变率均低于后者。在起始细胞被α-因子同步化细胞周期至G0/G1期的情况下，随着编辑时间的延长，细胞存活率和编辑突变率的降低和升高的变化趋势与在起始细胞未进行细胞周期同步化的情况下类似(图3-B)。CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1介导的编辑，其细胞存活率分别从8 h时间点的11.1‰和9.9‰逐渐下降到36 h时间点的4.2‰和0.8‰，分别下降了3倍和12倍；而编辑突变率分别从12 h时间点的0.74‰和0.09‰升高到36 h时间点的13.4‰和1.6‰，均约升高了18倍(图3-B)。与CRISPR/Cas9编辑相比，CRISPR/Cpf1编辑的细胞存活率和突变率均较低，表明细胞对CRISPR/Cpf1编辑产生的5′2–4-nt粘性末端DSB的易错修复能力可能低于对CRISPR/Cas9编辑产生的平末端或低频率的5′1-nt DSB的易错修复。另外，对于同一种编辑工具编辑相同的时间而言，经α-因子细胞周期同步化的细胞的存活率和突变率均低于未经同步化的细胞。NHEJ作为一种在细胞内自发进行的DSB修复途径，在整个细胞周期内都能发挥作用，且主要发生在G1期[26]，但是将细胞周期同步化至condition grown in glucose media(right panel);D:The maximum cell growth rate(μmax)of synchronized and unsynchronized cells.Cells were cultured with glucose(left panel,unediting)and galactose(right panel,editing).The parameter ofμmax was calculated corresponding to the fermentation profiles using Originlab?Origin 8.The strains were listed in Table 1.Data represent the mean and standard error of duplicate cultures at each condition.图3.未同步化和α-因子同步化细胞的基因组编辑效果评价
【参考文献】：
期刊论文
[1]酿酒酵母形态变化检验点的研究进展[J]. 祝嫦巍,史钧. 基因组学与应用生物学. 2016(05)
本文编号：3268411
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教材专著
