变性泡介导的链交换扩增（SEA）核酸检测方法的灵敏性研究
发布时间：2021-07-16 07:43
本文对于变性泡介导的链交换扩增（Strand Exchange Amplification,SEA）引物设计规则和快速SEA（accelerated SEA,ASEA）初步应用和核酸杂交特异性进行初步研究,主要的研究内容与结论如下:1.SEA引物设计策略:利用一系列Tm值的肺炎支原体引物研究引物Tm值与反应温度的最优组合;通过具有不同Tm值差异的沙眼衣原体和家猪引物的扩增效率研究引物Tm差异对扩增效率的影响;设计肺炎支原体和沙眼衣原体引物研究G/C含量对扩增效率的影响;根据沙眼衣原体和单增李斯特菌引物的扩增效率研究引物自身互补和3’端互补对扩增效率的影响;根据金黄色葡萄球菌的扩增效率确定引物Tm值和3’末端G/C含量的优先级。结果:引物Tm值及反应温度均为61℃时,SEA有最高的扩增效率;Tm值差异最小的引物对的阈值时间（Threshold time,Tt）值最低,而Tm值差异最大的引物对的Tt值最高;3’端G/C含量较高的引物表现出较低的Tt值;互补位点的数目与Tt值呈正相关,引物拥有的总潜在互补位点最少,Tt值最低;Tm值和Tm值的差异应优先于3’端G/C含量。结论:SEA引物设计...
【文章来源】：青岛大学山东省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
1LAMP反应原理
青岛大学硕士学位论文4具有更高的灵敏度和特异性，对PCR抑制剂也显示出更高的耐受度，得到了广泛的认可。LMAP反应含有6条引物和具有链置换活性的Bst聚合酶，反应首先通过两个内部引物和两个外部引物形成哑铃状的基本反应单元；然后通过环状引物加速反应，环状引物能够将LAMP反应速度提高两倍。4到6条引物对应DNA序列中6至8个不同的区域，这显示出其他检测方法不具有的出色的特异性，LAMP原理图如图1.1所示。LAMP近几年广泛应用于食品安全、癌症及传染性疾病检测中，显示出良好的应用前景。通过额外添加中性红、钙黄绿素及金纳米颗粒等试剂建立的可视化检测手段，使得LAMP反应成为更适用于基层单位的核酸检测手段[24-26]。然而LAMP的易污染特性也饱受诟病，由于高灵敏度即使存在较低浓度的污染也能够造成假阳性报告，有课题组尝试在引物中加入特定酶切位点，在反应前对体系中存在的污染进行酶切，而额外的内切酶在LAMP反应温度下失去活性，不会对反应产生影响，显示出良好的抗污染特性[27]。LAMP反应体系中存在大量的引物这使得引物之间很可能会形成二聚体，直接影响LAMP反应的扩增效率。EryuWang教授详细的探讨引物二聚体对LAMP反应扩增效率的影响，并提出了计算非特异性扩增吉布斯自由能变化的公式，提供LAMP引物设计的理论指导[28]。1.1.2.2变性泡介导的等温核酸扩增反应图1.1.2变性泡介导的等温核酸扩增原理图[31]Figure1.1.2theprincipleofdenaturationbubble-meditatedisothermalstrandexchangeamplification变性泡介导的等温核酸扩增是石超教授课题组在2016年提出使用具有链置换活性的DNA聚合酶在DNA双链的呼吸作用下，进行核酸扩增[29]。该方法只使一对引物，相比较LAMP反应3对引物而言更不容易产生引物二聚体，引物设计更为容
青岛大学硕士学位论文61.2.1.2二元探针图1.2.1二元探针反应原理图[41]Figure1.2.1Schematicdiagramofbinaryprobereaction二元探针是核酸探针中重要的一员，它是在直链探针的基础之上设计而来。标准的二元探针由两段短的核苷酸组成，并在探针末端标记上荧光供体和荧光受体，当反应体系中不存在靶标时，探针随机分布在溶液中，只有荧光供体能发出荧光；当反应体系中存在靶标时，识别相邻区域的两段探针被靶标拉近，通过能量共振转移作用使荧光受体发出荧光信号[42-43],二元探针反应原理图如图2.1所示。只有当两条探针识别特异序列彼此接近时，探针才能发出检测信号，而两条链结合到同一个非特异性靶标的可能性极低，因此二元探针具有较高的特异性。为了提高二元探针的信噪比NicholasJTurro等人开发了三染料二元探针，他们将FRET染料对和荧光受体分别标记在两条探针上，有效的提高了二元探针的信噪比[44]。二元探针分段式的设计，使得只有两个探针同时结合与同一个靶标时才能报告检测信号，这使得二元探针的杂交效率比直链探针更低，为此WeihongTan等人将二条探针用聚乙二醇（PEG）聚合物链连接，在保留二元探针高特异性的同时，提高了二元探针的杂交效率[45]。1.2.1.3分子信标分子信标（MB）是由一条核酸链形成的一种常见核酸探针。分子信标的环状部位为核酸识别区域用于识别并与特定序列结合的区域，在环状部位的两端具有5到6个互补碱基，当反应体系中不存在靶标时末端互补碱基互补结合使核酸链形成发卡状，将标记在核酸链末端的荧光基团和淬灭基团拉近，从而不会导致荧光发射；
【参考文献】：
硕士论文
[1]基于链交换扩增新方法对肺炎支原体核酸快速检测方法的研究[D]. 史文强.青岛大学 2019
本文编号：3286594
【文章来源】：青岛大学山东省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
1LAMP反应原理
青岛大学硕士学位论文4具有更高的灵敏度和特异性，对PCR抑制剂也显示出更高的耐受度，得到了广泛的认可。LMAP反应含有6条引物和具有链置换活性的Bst聚合酶，反应首先通过两个内部引物和两个外部引物形成哑铃状的基本反应单元；然后通过环状引物加速反应，环状引物能够将LAMP反应速度提高两倍。4到6条引物对应DNA序列中6至8个不同的区域，这显示出其他检测方法不具有的出色的特异性，LAMP原理图如图1.1所示。LAMP近几年广泛应用于食品安全、癌症及传染性疾病检测中，显示出良好的应用前景。通过额外添加中性红、钙黄绿素及金纳米颗粒等试剂建立的可视化检测手段，使得LAMP反应成为更适用于基层单位的核酸检测手段[24-26]。然而LAMP的易污染特性也饱受诟病，由于高灵敏度即使存在较低浓度的污染也能够造成假阳性报告，有课题组尝试在引物中加入特定酶切位点，在反应前对体系中存在的污染进行酶切，而额外的内切酶在LAMP反应温度下失去活性，不会对反应产生影响，显示出良好的抗污染特性[27]。LAMP反应体系中存在大量的引物这使得引物之间很可能会形成二聚体，直接影响LAMP反应的扩增效率。EryuWang教授详细的探讨引物二聚体对LAMP反应扩增效率的影响，并提出了计算非特异性扩增吉布斯自由能变化的公式，提供LAMP引物设计的理论指导[28]。1.1.2.2变性泡介导的等温核酸扩增反应图1.1.2变性泡介导的等温核酸扩增原理图[31]Figure1.1.2theprincipleofdenaturationbubble-meditatedisothermalstrandexchangeamplification变性泡介导的等温核酸扩增是石超教授课题组在2016年提出使用具有链置换活性的DNA聚合酶在DNA双链的呼吸作用下，进行核酸扩增[29]。该方法只使一对引物，相比较LAMP反应3对引物而言更不容易产生引物二聚体，引物设计更为容
青岛大学硕士学位论文61.2.1.2二元探针图1.2.1二元探针反应原理图[41]Figure1.2.1Schematicdiagramofbinaryprobereaction二元探针是核酸探针中重要的一员，它是在直链探针的基础之上设计而来。标准的二元探针由两段短的核苷酸组成，并在探针末端标记上荧光供体和荧光受体，当反应体系中不存在靶标时，探针随机分布在溶液中，只有荧光供体能发出荧光；当反应体系中存在靶标时，识别相邻区域的两段探针被靶标拉近，通过能量共振转移作用使荧光受体发出荧光信号[42-43],二元探针反应原理图如图2.1所示。只有当两条探针识别特异序列彼此接近时，探针才能发出检测信号，而两条链结合到同一个非特异性靶标的可能性极低，因此二元探针具有较高的特异性。为了提高二元探针的信噪比NicholasJTurro等人开发了三染料二元探针，他们将FRET染料对和荧光受体分别标记在两条探针上，有效的提高了二元探针的信噪比[44]。二元探针分段式的设计，使得只有两个探针同时结合与同一个靶标时才能报告检测信号，这使得二元探针的杂交效率比直链探针更低，为此WeihongTan等人将二条探针用聚乙二醇（PEG）聚合物链连接，在保留二元探针高特异性的同时，提高了二元探针的杂交效率[45]。1.2.1.3分子信标分子信标（MB）是由一条核酸链形成的一种常见核酸探针。分子信标的环状部位为核酸识别区域用于识别并与特定序列结合的区域，在环状部位的两端具有5到6个互补碱基，当反应体系中不存在靶标时末端互补碱基互补结合使核酸链形成发卡状，将标记在核酸链末端的荧光基团和淬灭基团拉近，从而不会导致荧光发射；
【参考文献】：
硕士论文
[1]基于链交换扩增新方法对肺炎支原体核酸快速检测方法的研究[D]. 史文强.青岛大学 2019
本文编号：3286594
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3286594.html
教材专著
