利用CRISPR/Cas9鉴定玉米发育相关基因ZmCen

发布时间：2021-08-08 09:38

　　目的:利用CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）系统构建玉米中心蛋白（Centrin）的表达载体,经转化后分析其对玉米生长发育的影响。方法:针对ZmCen基因的第一个外显子设计sgRNA,将其连入pOMS01-Cas9-ZmCensgRNA表达载体,转化农杆菌GV3101后,侵染玉米自交系材料B104的愈伤组织,经继代、诱导、分化成苗,筛选出转基因后代。对T₀代和T₁代基因组DNA进行PCR验证、测序及表型分析。结果:成功构建ZmCen的表达载体。侵染农杆菌后,PCR测序显示,T₀代和T₁代突变率分别为20.13%和64.52%,其中T₁代的纯合缺失突变率为5%。序列分析表明,ZmCen基因的编辑靶点附近发生了碱基的替换、插入或缺失。经与野生型表型比对发现,ZmCen突变体T₁代植株出现发育缓慢且雄花... 

【文章来源】：中国生物工程杂志. 2020,40(12)北大核心CSCD

【文章页数】：9 页

【部分图文】：

Zm Cen基因结构、靶标导向RNA的设计及p OMS01-Cas9-Zm Cen-gRNA载体构建及鉴定

经农杆菌介导转化的T0代再生植株，首先采用转基因抗除草剂Bar基因检测试纸条对T0代CRISPR/Cas9基因编辑玉米植株进行初步筛选。结果获得基因编辑载体的玉米植株，试纸条显示两条条带为阳性(+);野生型及未获得基因编辑载体的玉米植株只显示一条条带，为阴性(-)(图2a)。同时对T0代玉米提取基因组DNA进行PCR扩增，将扩增产物送公司测序分析(图2b)，测序结果与野生型玉米自交系B104的基因组DNA扩增结果序列比对如图3所示。

次年种植T0代种子，继续自交并结实，收获转基因植株。检测T1代转基因植株Zm Cen的突变情况，同时对T1代进行PCR扩增，与T0代产物测序比对分析(图3)，结果T0代和T1代均发生不同类型的碱基插入、缺失及替换。其中T0代最大缺失37bp(图3:T0-4);在62株T1代植株中，有10株发生单碱基插入突变，占总检测植株(62株)的16.13%，主要是碱基C的插入;11株发生碱基缺失突变，占总检测植株的17.74%,19株发生碱基替换突变，大部分为单碱基T的插入，占总检测植株的30.64%。其中纯合突变有“3”株，纯合突变率为5%(表3)。2.3 外源转化元件在纯合突变体中的分离鉴定

【参考文献】：
期刊论文
[1]玉米酵母双杂交cDNA文库的构建及ZmCEN互作蛋白的筛选[J]. 雷海英,白凤麟,段永红,王志军.  西北植物学报. 2018(04)



本文编号：3329714