FoxM1在骨骼肌发育与再生中的作用及机制研究
发布时间：2021-08-08 11:36
骨骼肌是哺乳动物机体重要的运动器官,约占人体总质量的40%。骨骼肌的生长和损伤后修复,对人体正常生理功能的维持具有重要意义。肌卫星细胞（Muscle satellite cells,SCs）是骨骼肌系统中具有长期自我更新和分化潜能的成体干细胞,起源于胚胎中胚层。在发育成熟的个体,SCs位于基膜与肌细胞膜之间,大多数处于静息状态。当肌肉受到损伤等刺激时,SCs被激活并开始增殖,增殖后的SCs一部分继续分化为肌细胞,形成肌束,以修复肌肉组织的损伤,另一部分则重新进入静息状态以维持干细胞池。可见,SCs在静止、增殖和分化之间的平衡转变对于干细胞池的维持和肌肉的稳态至关重要。近来不断有研究揭示多种转录因子、非编码RNA、多种激酶及表观修饰因子在SCs功能调控中的重要作用,但SCs的内在调控网络尚未完全解析。因此,深入挖掘调控SCs的分子网络,将有助于加深对SCs功能维持及骨骼肌生长发育的理解。FoxM1（Forkhead box protein M1）是叉头框蛋白家族成员,被鉴定为原癌基因,其在细胞增殖及肿瘤发生等方面发挥重要作用。现有研究揭示FoxM1主要通过转录调控细胞周期相关基因的表达,...
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
SCs特异性FoxM1敲除小鼠模型构建策略
第3章FoxM1缺失对小鼠肌肉生长发育与再生功能的影响19杂交，选取FoxM1fl/+-Pax7-Cre小鼠与FoxM1fl/fl交配，得到FoxM1fl/fl-Pax7-Cre小鼠。FoxM1fl/fl-Pax7-Cre与FoxM1fl/fl交配，后代基因型FoxM1fl/fl-Pax7-Cre的小鼠作为实验鼠，同窝同性别，基因型为FoxM1fl/fl的小鼠作为对照鼠。FoxM1fl/+小鼠携带FoxM1基因座，外显子4至7两侧有两个loxp位点，在Pax7启动子控制下，Cre重组酶表达后，切除FoxM1第4-7外显子，实现在SCs中特异性敲除FoxM1，如图3.1所示。图3.1SCs特异性FoxM1敲除小鼠模型构建策略Fig.3.1ConstructionstrategyofSCsspecificFoxM1knockoutmousemodel3.4.2SCs特异性FoxM1敲除小鼠的鉴定实验中获得的FoxM1fl/fl-Pax7-Cre小鼠，用FoxM1-cKO小鼠来表示（下文中均以此代表SCs特异性FoxM1敲除小鼠）。取分离培养的FoxM1+/+、FoxM1fl/fl和FoxM1-cKO小鼠的SCs，碱裂解法裂解细胞释放基因组DNA，采用基因分型PCR鉴定小鼠基因型（引物设计思路见图3.1），WT基因鉴定条带：220bp，fl/fl基因鉴定条带：280bp，敲除鉴定基因：400bp。如图3.2，结果显示我们的小鼠构建策略的有效性。图3.2SCs特异性FoxM1敲除小鼠基因型鉴定Fig.3.2GenotypingofSCs-specificFoxM1knockoutmice.
西南大学硕士学位论文203.4.3SCs特异性FoxM1敲除效率的检测为了进一步探究FoxM1在SCs中的敲除效率，我们通过流式分选法获得FoxM1fl/fl和FoxM1-cKO小鼠SCs，提取RNA并进行RT-qPCR实验，结果显示在FoxM1-cKO小鼠SCs中FoxM1的表达显著降低（图3.3A）。此外我们通过组织培养法分离SCs，在体外培养后裂解细胞并利用Westernblot分析FoxM1的表达情况，结果也证实了FoxM1的敲除效率（图3.3B）。以上结果表明SCs特异性FoxM1敲除小鼠模型构建成功。图3.3SCs中FoxM1特异性敲除效率检测（A）RT-qPCR检测mRNA水平FoxM1的表达。（B）Westernblot法测定蛋白水平FoxM1和Tubulin（内参）的表达。（误差条表示平均值±SD。**p<0.01；t-test）。Fig.3.3DetectionofFoxM1specificknockoutefficiencyinSCs.(A)QuantitativeRT-PCRanalysisofFoxM1expressioninmRNAlevel.(B)ExpressionsofFoxM1andTubulin(loadingcontrol)weredeterminedbywesternblotanalysisatproteinlevel.(Errorbarsrepresentthemeans±SD.**p<0.01;Student’st-test).3.4.4FoxM1缺失导致肌肉萎缩分别取适龄FoxM1fl/fl小鼠和FoxM1-cKO小鼠TA进行视觉观察，用微量天平称重，发现2月龄FoxM1-cKO小鼠的TA重量较对照组无明显的差异（图3.4B），但在8月龄时FoxM1-cKO小鼠TA质量有所下降（图3.4C）。消化处理肌肉组织，分离获得EDL单根肌纤维，固定后利用DAPI染色，统计单根肌纤维上肌细胞核的数目，结果显示，2月龄FoxM1-cKO小鼠肌肉组织中肌细胞核的数量与对照组相比无明显差异（图3.5B），但8月龄FoxM1-cKO小鼠的肌细胞核的数量减少（图3.5C）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]肌源性干/祖细胞对造血干细胞分化、支持的研究进展[J]. 古晶晶,郑波. 重庆医学. 2019(07)
[2]MicroRNA调控哺乳动物骨骼肌发育[J]. 李新云,付亮亮,程会军,赵书红. 遗传. 2017(11)
本文编号：3329881
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
SCs特异性FoxM1敲除小鼠模型构建策略
第3章FoxM1缺失对小鼠肌肉生长发育与再生功能的影响19杂交，选取FoxM1fl/+-Pax7-Cre小鼠与FoxM1fl/fl交配，得到FoxM1fl/fl-Pax7-Cre小鼠。FoxM1fl/fl-Pax7-Cre与FoxM1fl/fl交配，后代基因型FoxM1fl/fl-Pax7-Cre的小鼠作为实验鼠，同窝同性别，基因型为FoxM1fl/fl的小鼠作为对照鼠。FoxM1fl/+小鼠携带FoxM1基因座，外显子4至7两侧有两个loxp位点，在Pax7启动子控制下，Cre重组酶表达后，切除FoxM1第4-7外显子，实现在SCs中特异性敲除FoxM1，如图3.1所示。图3.1SCs特异性FoxM1敲除小鼠模型构建策略Fig.3.1ConstructionstrategyofSCsspecificFoxM1knockoutmousemodel3.4.2SCs特异性FoxM1敲除小鼠的鉴定实验中获得的FoxM1fl/fl-Pax7-Cre小鼠，用FoxM1-cKO小鼠来表示（下文中均以此代表SCs特异性FoxM1敲除小鼠）。取分离培养的FoxM1+/+、FoxM1fl/fl和FoxM1-cKO小鼠的SCs，碱裂解法裂解细胞释放基因组DNA，采用基因分型PCR鉴定小鼠基因型（引物设计思路见图3.1），WT基因鉴定条带：220bp，fl/fl基因鉴定条带：280bp，敲除鉴定基因：400bp。如图3.2，结果显示我们的小鼠构建策略的有效性。图3.2SCs特异性FoxM1敲除小鼠基因型鉴定Fig.3.2GenotypingofSCs-specificFoxM1knockoutmice.
西南大学硕士学位论文203.4.3SCs特异性FoxM1敲除效率的检测为了进一步探究FoxM1在SCs中的敲除效率，我们通过流式分选法获得FoxM1fl/fl和FoxM1-cKO小鼠SCs，提取RNA并进行RT-qPCR实验，结果显示在FoxM1-cKO小鼠SCs中FoxM1的表达显著降低（图3.3A）。此外我们通过组织培养法分离SCs，在体外培养后裂解细胞并利用Westernblot分析FoxM1的表达情况，结果也证实了FoxM1的敲除效率（图3.3B）。以上结果表明SCs特异性FoxM1敲除小鼠模型构建成功。图3.3SCs中FoxM1特异性敲除效率检测（A）RT-qPCR检测mRNA水平FoxM1的表达。（B）Westernblot法测定蛋白水平FoxM1和Tubulin（内参）的表达。（误差条表示平均值±SD。**p<0.01；t-test）。Fig.3.3DetectionofFoxM1specificknockoutefficiencyinSCs.(A)QuantitativeRT-PCRanalysisofFoxM1expressioninmRNAlevel.(B)ExpressionsofFoxM1andTubulin(loadingcontrol)weredeterminedbywesternblotanalysisatproteinlevel.(Errorbarsrepresentthemeans±SD.**p<0.01;Student’st-test).3.4.4FoxM1缺失导致肌肉萎缩分别取适龄FoxM1fl/fl小鼠和FoxM1-cKO小鼠TA进行视觉观察，用微量天平称重，发现2月龄FoxM1-cKO小鼠的TA重量较对照组无明显的差异（图3.4B），但在8月龄时FoxM1-cKO小鼠TA质量有所下降（图3.4C）。消化处理肌肉组织，分离获得EDL单根肌纤维，固定后利用DAPI染色，统计单根肌纤维上肌细胞核的数目，结果显示，2月龄FoxM1-cKO小鼠肌肉组织中肌细胞核的数量与对照组相比无明显差异（图3.5B），但8月龄FoxM1-cKO小鼠的肌细胞核的数量减少（图3.5C）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]肌源性干/祖细胞对造血干细胞分化、支持的研究进展[J]. 古晶晶,郑波. 重庆医学. 2019(07)
[2]MicroRNA调控哺乳动物骨骼肌发育[J]. 李新云,付亮亮,程会军,赵书红. 遗传. 2017(11)
本文编号：3329881
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