直扩RPA核酸即时可视化检测技术研究
发布时间：2021-08-15 22:28
重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification,RPA）是利用重组酶和单链结合蛋白在常温下协同实现引物与模板的特异结合,以代替传统PCR热循环中的变性和复性过程的新型恒温体外核酸扩增技术。本研究基于RPA技术建立了转基因玉米TC1507的检测方法,可在36.7℃恒温条件下快速检测到转基因玉米TC1507中的保守区段,具有较好的特异性,其检测灵敏度达到了10-2ng/μL,检测时间只需5分钟,适用于基层实验室及现场快速检测转基因玉米TC1507及其制品;此外,对于金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SAU）,建立了一种基于重组酶聚合酶介导的等温扩增技术（RPA）快速检测金黄色葡萄球菌的方法。方法根据金黄色葡萄球菌基因保守序列设计的2对引物,以金黄色葡萄球菌阳性菌株和其他7种非金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,考察该方法的检测灵敏度和特异性。结果RPA快速检测金黄色葡萄球菌方法仅需5 min,检测灵敏度为101cfu/μL;7种非金黄色葡萄球菌均不能扩增,特异性较强。本研究建立了金黄色葡萄球菌的RPA快速检测方法,具有...
【文章来源】：上海师范大学上海市
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
RPA扩增的原理
上海师范大学硕士学位论文第2章转基因玉米TC1507的RPA方法的建立17特定的设计引物软件，因此需要人工手动根据设计原则设计引物。由此设计了3组特异性较好的引物，合成后进行引物筛眩（具体序列见表1同2.1.1）实验结果如图2。其中T10泳道的扩增效果较好，因此选用T10-F/T10-R作为后续RPA扩增反应的引物。M：Marker；T6：转基因玉米TC1507-T6-F/T6-R；N6：非转基因玉米-T6-F/T6-R；T9：转基因玉米TC1507-T9-F/T9-R；N6:非转基因玉米-T9-F/T9-R；T10.转基因玉米TC1507-T10-F/T10-R；N10.非转基因玉米-T10-F/T10-R；2.3.2转基因玉米TC1507RPA反应时间优化和温度优化通过比对获取的模板和优化后的引物，对RPA扩增反应所需要的反应条件进行了进一步的优化，对RPA反应温度和RPA反应时间分别进行优化。根据参考大量文献得知通常RPA的反应温度通常在32℃至42℃之间，因此我们在32℃至42℃之间按照温度从低到高选取了11个温度梯度进行RPA扩增试验，实验结果如图3，其中在第5和第6泳道有明显条带，最终选取36.7℃作为最适温度。M：Marker；1：32℃；2：32.5℃；3：33.2℃；4：34.1℃；5：35.5℃；6：36.7℃；7：37.6℃；8：38.9℃；9：40.1℃；10：41.1℃；11：41.7℃图2TC1507RPA引物筛选结果Fig.2ScreeningofRPAprimerforTC1507图3TC1507RPA反应温度优化Fig.3RPAtemperatureoptimizationofTC1507
第2章转基因玉米TC1507的RPA方法的建立上海师范大学硕士学位论文18同时对反应时间做了进一步优化，将反应时间从5min至20min按照时间从短到长选取了4个温度梯度分别进行RPA扩增试验。试验结果如图4，其中第3、5、7泳道效果都较为理想，但第三泳道时间较短，只有8min，适合于快速检测，其条带也较为明亮。所用最终选取8min作为最终反应时间。M：Marker；1：5min；2：空白对照（ddH2O）/5min；3：8min；4：空白对照（ddH2O）/8min；5：15min；6：空白对照（ddH2O）/15min；7：20min；8：空白对照（ddH2O）/20min2.3.3转基因玉米TC1507RPA特异性验证采用2.3.1筛选出的引物T10-F/T10-R，2.3.2优化后的反应温度36.7℃，反应时间8min作为反应条件，对本实验的特异性进行了检测，由图1的N10泳道和图3的4泳道作为实验特异性试验的前提条件，分别以非转基因玉米和ddH2O作为模板，几乎没有非特异性条带，证明在实验过程中基本可以避免实验污染。分别对转基因玉米TC1507、转基因玉米BT176、转基因玉米GA21，以及采购于市场的非转基因玉米、大豆、油菜籽、小麦和棉花抽提DNA进行RPA扩增试验，实验结果如图5，仅在第1泳道有条带，说明该体系的特异性较好。为了更加快速直观地观察实验结果，在RPA扩增反应停止后，在RPA扩增反应0.2mL的eppendorf管中分别加入2μL的105×SYBRGreenI染料，涡旋震荡后在阳光或者日光灯下通过肉眼观察实验结果，仅在第1泳道呈阳性绿色，其余泳道均为橘色，再次证实了该体系对转基因玉米TC1507的特异性较好。图4TC1507RPA反应时间优化Fig.4RPAtimeoptimizationofTC1507
【参考文献】：
期刊论文
[1]一种新型免疫层析技术在临床乳腺癌Her-2蛋白定量检测中的应用[J]. 张洁莹,岳洋,邓桥生,糜军. 中国生物化学与分子生物学报. 2020(04)
[2]粮食经济视角下河南省转基因作物的知识产权保护[J]. 乔娇娇. 广西质量监督导报. 2019(12)
[3]转基因育种与传统育种[J]. 刘昭军. 大豆科技. 2019(05)
[4]2018年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势[J]. International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications China Biotechnology;. 中国生物工程杂志. 2019(08)
[5]转基因大豆MON89788实时荧光重组酶聚合酶扩增检测方法的建立[J]. 谢实龙,汪小福,丁晨露,祝旋,汤婷,马同富,蔡健,徐俊锋. 农业生物技术学报. 2019(07)
[6]侧流层析–重组酶聚合酶扩增技术快速检测土拉弗朗西斯菌[J]. 彭遥,阚飙,夏连续,李伟,张雯,秦爱平,卢金星. 疾病监测. 2019(05)
[7]重组酶聚合酶扩增技术快速检测转基因玉米Bt11[J]. 刘静,武国干,吴潇,刘华,王金斌,吕贝贝,蒋玮,唐雪明. 上海农业学报. 2018(01)
[8]沙门氏菌重组酶聚合酶检测方法的建立及应用[J]. 刘立兵,耿云云,姜彦芬,刘思颖,孙晓霞,南汇珠,王建昌. 食品科学. 2019(02)
[9]非洲猪瘟病毒实验室检测方法研究进展[J]. 庄金秋,梅建国,谢金文,李峰,沈志强. 饲料与畜牧. 2017(22)
[10]塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增技术（RPA）实时荧光检测方法的建立[J]. 樊晓旭,哈登楚日亚,王英丽,王姣,刘春菊,迟田英,赵永刚,张志诚,吴晓东,王志亮. 中国动物检疫. 2017(08)
博士论文
[1]中国大麦供给需求研究[D]. 张琳.中国农业科学院 2014
[2]可变盐单胞菌中草甘膦抗性EPSP合酶新基因克隆、大肠杆菌表达及其抗性机制的研究[D]. 刘柱.四川大学 2004
硕士论文
[1]转基因成分重组酶聚合酶扩增（RPA）快速检测方法的建立[D]. 谢实龙.阜阳师范学院 2019
[2]玉米转基因和胞质不育检测方法研究[D]. 晏朋涛.河南农业大学 2018
[3]非洲猪瘟病毒重组酶聚合酶扩增（RPA）方法的建立[D]. 哈登楚日亚.内蒙古农业大学 2017
[4]流行性乙型脑炎RT-RPA-LFD检测方法的建立与评价[D]. 梁辉.华南农业大学 2016
[5]对虾WSSV和IHHNV病毒重组酶聚合酶扩增（RPA）快速检测方法的研究[D]. 夏小明.上海海洋大学 2015
[6]大麦黄花叶病抗性鉴定及相关QTL定位[D]. 李建波.扬州大学 2015
[7]重组酶介导的等温扩增技术在转基因检测中的应用[D]. 徐潮.中国农业科学院 2014
[8]中国啤酒大麦产业发展研究[D]. 孔祥国.中国农业科学院 2013
[9]食品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法研究[D]. 张超楠.吉林大学 2012
[10]抗真菌双T-DNA植物表达载体构建及农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化[D]. 李永生.甘肃农业大学 2012
本文编号：3345050
【文章来源】：上海师范大学上海市
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
RPA扩增的原理
上海师范大学硕士学位论文第2章转基因玉米TC1507的RPA方法的建立17特定的设计引物软件，因此需要人工手动根据设计原则设计引物。由此设计了3组特异性较好的引物，合成后进行引物筛眩（具体序列见表1同2.1.1）实验结果如图2。其中T10泳道的扩增效果较好，因此选用T10-F/T10-R作为后续RPA扩增反应的引物。M：Marker；T6：转基因玉米TC1507-T6-F/T6-R；N6：非转基因玉米-T6-F/T6-R；T9：转基因玉米TC1507-T9-F/T9-R；N6:非转基因玉米-T9-F/T9-R；T10.转基因玉米TC1507-T10-F/T10-R；N10.非转基因玉米-T10-F/T10-R；2.3.2转基因玉米TC1507RPA反应时间优化和温度优化通过比对获取的模板和优化后的引物，对RPA扩增反应所需要的反应条件进行了进一步的优化，对RPA反应温度和RPA反应时间分别进行优化。根据参考大量文献得知通常RPA的反应温度通常在32℃至42℃之间，因此我们在32℃至42℃之间按照温度从低到高选取了11个温度梯度进行RPA扩增试验，实验结果如图3，其中在第5和第6泳道有明显条带，最终选取36.7℃作为最适温度。M：Marker；1：32℃；2：32.5℃；3：33.2℃；4：34.1℃；5：35.5℃；6：36.7℃；7：37.6℃；8：38.9℃；9：40.1℃；10：41.1℃；11：41.7℃图2TC1507RPA引物筛选结果Fig.2ScreeningofRPAprimerforTC1507图3TC1507RPA反应温度优化Fig.3RPAtemperatureoptimizationofTC1507
第2章转基因玉米TC1507的RPA方法的建立上海师范大学硕士学位论文18同时对反应时间做了进一步优化，将反应时间从5min至20min按照时间从短到长选取了4个温度梯度分别进行RPA扩增试验。试验结果如图4，其中第3、5、7泳道效果都较为理想，但第三泳道时间较短，只有8min，适合于快速检测，其条带也较为明亮。所用最终选取8min作为最终反应时间。M：Marker；1：5min；2：空白对照（ddH2O）/5min；3：8min；4：空白对照（ddH2O）/8min；5：15min；6：空白对照（ddH2O）/15min；7：20min；8：空白对照（ddH2O）/20min2.3.3转基因玉米TC1507RPA特异性验证采用2.3.1筛选出的引物T10-F/T10-R，2.3.2优化后的反应温度36.7℃，反应时间8min作为反应条件，对本实验的特异性进行了检测，由图1的N10泳道和图3的4泳道作为实验特异性试验的前提条件，分别以非转基因玉米和ddH2O作为模板，几乎没有非特异性条带，证明在实验过程中基本可以避免实验污染。分别对转基因玉米TC1507、转基因玉米BT176、转基因玉米GA21，以及采购于市场的非转基因玉米、大豆、油菜籽、小麦和棉花抽提DNA进行RPA扩增试验，实验结果如图5，仅在第1泳道有条带，说明该体系的特异性较好。为了更加快速直观地观察实验结果，在RPA扩增反应停止后，在RPA扩增反应0.2mL的eppendorf管中分别加入2μL的105×SYBRGreenI染料，涡旋震荡后在阳光或者日光灯下通过肉眼观察实验结果，仅在第1泳道呈阳性绿色，其余泳道均为橘色，再次证实了该体系对转基因玉米TC1507的特异性较好。图4TC1507RPA反应时间优化Fig.4RPAtimeoptimizationofTC1507
【参考文献】：
期刊论文
[1]一种新型免疫层析技术在临床乳腺癌Her-2蛋白定量检测中的应用[J]. 张洁莹,岳洋,邓桥生,糜军. 中国生物化学与分子生物学报. 2020(04)
[2]粮食经济视角下河南省转基因作物的知识产权保护[J]. 乔娇娇. 广西质量监督导报. 2019(12)
[3]转基因育种与传统育种[J]. 刘昭军. 大豆科技. 2019(05)
[4]2018年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势[J]. International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications China Biotechnology;. 中国生物工程杂志. 2019(08)
[5]转基因大豆MON89788实时荧光重组酶聚合酶扩增检测方法的建立[J]. 谢实龙,汪小福,丁晨露,祝旋,汤婷,马同富,蔡健,徐俊锋. 农业生物技术学报. 2019(07)
[6]侧流层析–重组酶聚合酶扩增技术快速检测土拉弗朗西斯菌[J]. 彭遥,阚飙,夏连续,李伟,张雯,秦爱平,卢金星. 疾病监测. 2019(05)
[7]重组酶聚合酶扩增技术快速检测转基因玉米Bt11[J]. 刘静,武国干,吴潇,刘华,王金斌,吕贝贝,蒋玮,唐雪明. 上海农业学报. 2018(01)
[8]沙门氏菌重组酶聚合酶检测方法的建立及应用[J]. 刘立兵,耿云云,姜彦芬,刘思颖,孙晓霞,南汇珠,王建昌. 食品科学. 2019(02)
[9]非洲猪瘟病毒实验室检测方法研究进展[J]. 庄金秋,梅建国,谢金文,李峰,沈志强. 饲料与畜牧. 2017(22)
[10]塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增技术（RPA）实时荧光检测方法的建立[J]. 樊晓旭,哈登楚日亚,王英丽,王姣,刘春菊,迟田英,赵永刚,张志诚,吴晓东,王志亮. 中国动物检疫. 2017(08)
博士论文
[1]中国大麦供给需求研究[D]. 张琳.中国农业科学院 2014
[2]可变盐单胞菌中草甘膦抗性EPSP合酶新基因克隆、大肠杆菌表达及其抗性机制的研究[D]. 刘柱.四川大学 2004
硕士论文
[1]转基因成分重组酶聚合酶扩增（RPA）快速检测方法的建立[D]. 谢实龙.阜阳师范学院 2019
[2]玉米转基因和胞质不育检测方法研究[D]. 晏朋涛.河南农业大学 2018
[3]非洲猪瘟病毒重组酶聚合酶扩增（RPA）方法的建立[D]. 哈登楚日亚.内蒙古农业大学 2017
[4]流行性乙型脑炎RT-RPA-LFD检测方法的建立与评价[D]. 梁辉.华南农业大学 2016
[5]对虾WSSV和IHHNV病毒重组酶聚合酶扩增（RPA）快速检测方法的研究[D]. 夏小明.上海海洋大学 2015
[6]大麦黄花叶病抗性鉴定及相关QTL定位[D]. 李建波.扬州大学 2015
[7]重组酶介导的等温扩增技术在转基因检测中的应用[D]. 徐潮.中国农业科学院 2014
[8]中国啤酒大麦产业发展研究[D]. 孔祥国.中国农业科学院 2013
[9]食品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法研究[D]. 张超楠.吉林大学 2012
[10]抗真菌双T-DNA植物表达载体构建及农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化[D]. 李永生.甘肃农业大学 2012
本文编号：3345050
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3345050.html
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