利用CRISPR/Cas9系统构建TiKi1和TiKi2双基因敲除兔

发布时间：2021-08-17 00:35

　　Tiki基因为新发现的基因,在蛙上的功能研究证实Tiki在头部诱导的过程中起着决定性的作用。由于TiKi基因包含TiKi2和TiKi1两种类型,因此建立一种同时敲除TiKi2和TiKi1两种基因的兔模型,能更好地研究TiKi基因是否影响兔头部的早期发育。本研究通过CRISPR/Cas9系统结合原核期受精卵RNA胞质内显微注射来建立家兔双基因打靶技术体系。考虑到TiKi1和TiKi2的同源性比较高,可能相互之间存在补偿效应,于是设计了一个gRNA能同时靶向TiKi1和TiKi2。将200 ng/μL Cas9 mRNA和20 ng/μL gRNA注射到51个处于原核期的家兔受精卵的胞质内,移植到6只受体兔体内,共计生出12只仔兔,经测序鉴定其中有1只仔兔为TiKi1和TiKi2双等位基因敲除模型。结果表明CRISPR/Cas9系统对于家兔双基因修饰研究是一种高效和简便的工具,成功建立的TiKi1和TiKi2双基因敲除兔模型在评估新药疗效、基因治疗等的研究领域中将具有很大的应用潜力。 

【文章来源】：畜牧与兽医. 2020,52(03)北大核心

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

新生仔兔Tiki2基因突变结果

以200 ng/μL Cas9 mRNA和20 ng/μL gRNA的浓度注射处于原核期的家兔受精卵的胞质内,注射的胚胎在胚胎培养液于培养箱中培养至囊胚期(4 d左右),来检测注射的RNA是否具有对家兔相应的靶位点进行切割的作用,并统计其打靶效率。当注射200 ng/μL Cas9 mRNA和20 ng/μL Tiki1+Tiki2gRNA时,注射12个原核期的受精卵,囊赔率为75%。对这些发育正常的囊胚进行PCR扩增测序基因打靶效率检测,若测序结果只有一套峰图(图1A),则直接与WT序列进行比对;若测序结果在靶位点附近存在两套及两套以上的峰图(图1B),则回收该PCR产物并与T载体连接,然后挑选单克隆进行测序。在这9个囊胚中,经过PCR扩增测序发现9个囊胚(100%)都发生了Tiki1基因打靶,其中在5个(56%)囊胚中检测到WT的序列,定义为Tiki1单等位基因敲除;剩下的4个(44%)没有检测到WT的序列是属于Tiki1双等位基因敲除(见表2);经过PCR扩增测序发现9个囊胚(100%)都发生了Tiki2基因打靶,其中在6个(67%)囊胚中检测到WT的序列,我们定义为Tiki2单等位基因敲除;剩下的3个(33%)没有检测到WT的序列是属于Tiki2双等位基因敲除(见表2)。表2 注射后家兔受精卵Tiki1和Tiki2基因修饰结果 靶基因 浓度(gRNA/cas9) 囊胚数 基因修饰效率(%) 双等位基因敲除率(%) Tiki1 20/200(ng/μL) 9 9/9(100) 4/9(44) Tiki2 20/200(ng/μL) 9 9/9(100) 3/9(33)

对测序结果在靶位点附近存在两套及两套以上峰图的仔兔的PCR 产物,回收并与T载体连接,然后挑选单克隆进行测序,再与WT序列比对,突变范围从插入21 bp到缺失209 bp不等(图3)。图3 新生仔兔Tiki2基因突变结果


本文编号：3346702