双孢蘑菇中精氨酸酶的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

发布时间：2021-08-17 17:54

　　目的提供一种制备精氨酸酶特异性多克隆抗体的方法。方法首先对双孢蘑菇中编码精氨酸酶的基因（AbArg）进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增,构建重组质粒pET-28a（+）-Arg,再将质粒转入感受态细胞E.coli BL 21中诱导表达,获得含有6×His标签的融合蛋白,最后用纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗血清。结果构建了重组质粒pET-28a（+）-Arg,聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表明诱导出的融合蛋白以包涵体形式存在,经纯化后得到的融合蛋白纯度>90%、浓度>0.5 mg/ml。用间接ELISA法测定抗体的效价达51 200。Western印迹实验表明制备的多克隆抗体特异性良好,可成功识别双孢蘑菇中的精氨酸酶蛋白。结论成功制备了精氨酸酶的多克隆抗体,为进一步研究精氨酸代谢的机制奠定了基础。 

【文章来源】：国际药学研究杂志. 2020,47(08)北大核心

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

Ab Arg基因的PCR扩增及重组载体的双酶切验证注：A.PCR扩增Ab Arg基因；M1.2 kb DNA marker;1.Ab Arg基因的PCR扩增产物；B.重组载体的双酶切验证；M2.1kb DNA marker;2.重组质粒p ET-28a(+)-Arg被Eco RⅠ和HindⅢ双酶切

对抗血清进行检测后发现非特异性吸附产生的杂带较多，因此对抗血清进行了纯化。用Protein A亲和层析介质纯化Anti-ARG多克隆抗体，Protein A的免疫球蛋白结合域可特异性地结合抗体的Fc区，从而去除其他抗体分子。将纯化后抗体进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果表明多数非特异性抗体被去除干净，得到了纯度较高的Anti-ARG抗体（图5）。图4 间接ELISA法测定抗血清的效价

图3 SDS-PAGE电泳法检测融合蛋白的亲和纯化注：M.预染蛋白marker;1.菌体超声破碎后的沉淀液；2.菌体超声破碎后的上清液；3.与镍柱结合后的流穿液；4～7.亲和纯化后的洗脱液2.6 WB分析多克隆抗体的特异性

【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
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本文编号：3348223