高效Rubisco羧化活性筛选体系的设计与构建

发布时间：2021-08-19 15:16

　　【背景】广泛存在于植物、藻类及其他自养微生物中的核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）是卡尔文循环中固定CO2的关键酶及限速酶,在生物质合成和全球碳循环中扮演着重要角色。鉴于Rubisco的重要性以及极低的固碳羧化活性,对Rubisco的筛选进化研究具有重要意义。【目的】构建一种适用于筛选高效Rubisco羧化活性的筛选体系。【方法】分析现有筛选体系对Rubisco羧化活性筛选压力缺失的原因,设计构建适用于高效Rubisco羧化活性的筛选体系,以BWLac产乳酸菌株为宿主,在含有5%CO2的N2环境下厌氧培养,比较不同羧化活性Rubisco对细胞生长的影响,通过HPLC及LCMS检测总乳酸及固定CO2生成乳酸的产量评估筛选体系。【结果】通过终端代谢产物乳酸产生下拉力,以及甘油代谢产生的剩余还原力需要平衡消耗掉的设计靶点,增强Prk和Rubisco的固碳支路代谢通量,加强RuBP对细胞的毒性抑制作用,使细胞生长与Rubisco活性有效偶联,构建高通量筛选办法。在新构建的筛选体系中,Rubisco失活突变体BWLac/197不能生长,Rubisco和Prk双失活突变体BWLa... 

【文章来源】：微生物学通报. 2020,47(08)北大核心CSCD

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【部分图文】：

高效羧化活性筛选体系Rubisco平板生长情况

通过细胞生长的菌落大小来表征Rubisco羧化活性的高通量筛选方法，筛选获得的酶分子是总活性的提高，不能区别可溶性表达的提高和比酶活提高的差异，这也是所有酶分子定向进化筛选突变体的共性问题。此前已有报道，关于来源于Synechococcus sp.PCC6301的Rubisco进化，获得了大亚基Rbc L F345I突变株，其可溶性提高了近7倍，而羧化作用的催化效率降低了17%[14]。为了尽可能避免筛选到可溶性表达的Rubisco，本研究中应用22°C低温诱导表达Rubisco，以及25°C的平板筛选培养温度，目的是尽可能减少Rubisco诱导表达过程中形成不可溶包涵体，从而降低筛选到Rubisco可溶性表达提高的可能性。图6 不同羧化活性Rubisco的产乳酸能力评价

针对2.1节中现有筛选体系不能筛选获得羧化活性更高的Rubisco酶分子元件的问题，希望通过增加Prk和Rubisco的固碳支路代谢通量，提高RuBP细胞毒性的抑制作用，放大Rubisco羧化活性差异在细胞生长方面的体现。为此，从两个方面考虑设计如何增强Rubisco的固碳代谢通量，设计原理示意图如图2所示。一是以乳酸终端代谢产物形成下拉力，为Rubisco羧化活性固定的CO2找到终端出口，设计强化丙酮酸到乳酸终端代谢产物的代谢路径，阻断丙酮酸到乙酰CoA的甲酸裂解酶PflB活性，以及丙酮酸到琥珀酸的琥珀酸脱氢酶Frd活性，使乳酸成为细胞在厌氧条件下丙酮酸代谢的主要代谢终产物，通过乳酸的代谢生成持续拉动Prk和Rubisco固碳支路；二是依据甘油代谢产乳酸剩余还原力NADH的特征，见反应式(1)，设计通过Prk和Rubisco支路代谢利用木糖，固定CO2生成乳酸，如反应式(2)所示，消耗甘油代谢产乳酸剩余的NADH，从而平衡胞内还原力，也就是说，通过甘油代谢产乳酸的过剩还原力，增强Prk和Rubisco固碳支路代谢通量(图2)。图2 高效Rubisco羧化活性筛选体系设计原理图


本文编号：3351649