纳尔逊海湾正呼肠孤病毒复制对细胞自噬的影响及相关非结构蛋白研究

发布时间：2021-08-22 07:40

　　目的:纳尔逊海湾正呼肠孤病毒（Nelson Bay orthoreoviruses,NBV）最初是40多年前从澳大利亚果蝠中分离出来的,独立形式存在且不与任何疾病发生关联。然而,最近已经证实了有几株NBV是人类呼吸道感染的病原体,并从一些急性呼吸道疾病患者的体内分离出的病原体显示,NBV已经进化为人畜共患病的形式,且可在人类中传播。致病性NBV能引起人类急性呼吸道及肠道炎症,并且在东南亚地区呈逐步漫延的趋势。2007年日本学者TAKAHIRO等首次利用RNA病毒的反向遗传学系统,成功制备出重组NBV-MB,为深入研究NBV致病机理奠定基础。自噬是一种真核细胞为维持细胞自身稳态进行的一种生理性代谢代偿过程。自噬是一种进化保守的细胞自救行为,对维持细胞稳态和应激条件下细胞的存活有重要意义。自噬是真核细胞中进化上保守的过程,降解细胞内底物,参与多种生理过程,并维持细胞稳态。此外,自噬还具有清除感染细胞内细菌和病毒的重要功能。正常情况下,自噬程序处于基础水平状态,但是受到各种胞内和胞外刺激时会被激活。然而,某些病毒显然不受自噬的影响,许多病毒已进化为逃避或利用此机制以各种方式促进其存活和复制。... 

【文章来源】：中国医科大学辽宁省

【文章页数】：88 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

NBV反向遗传系统示意图

中国医科大学博士学位论文153结果3.1重组NBV-MB病毒株的检测为了检测重组病毒的感染性，用制备的重组NBV-MB病毒感染BHK细胞，24h后通过光学显微镜观察细胞变化，并通过免疫荧光方法检测NBV非结构蛋白σNS的表达情况。如图1.2A所示，NBV-MB病毒感染的BHK细胞中，通过显微镜可以观察到细胞出现变圆、坏死，从培养皿底壁上脱落，产生明显的细胞病变效应（Cytopathiceffect,CPE），而未感染病毒的细胞中则未发现CPE。用制备的NBV-MB病毒感染BHK细胞24h，进行免疫荧光检测NBV非结构蛋白σNS，结果如图1.2B所示，NBV-MB病毒感染细胞检测到荧光信号，而未感染组细胞未检测到荧光信号。这些结果证实了本实验成功制备了NBV-MB，并可用于后续的研究。AB图1.2重组NBV-MB感染BHK细胞A：正常光源下显微镜观察感染的BHK细胞（200×）。B：荧光显微镜观察重组病毒感染的BHK细胞,红色荧光标记的为σNS蛋白（200×）。

中国医科大学博士学位论文163.2空斑检测NBV-MB的滴度重组病毒感染单个细胞并向四周扩散形成肉眼可见可数的空斑，观察并计数，根据公式计算：病毒滴度(PFU/m1)=(每孔平均空斑个数×病毒稀释度倒数)／每孔病毒接种量(m1)。为了计数更精确，一般根据能清楚观察到空斑的最大稀释倍数的孔计算，结果显示制备的重组病毒滴度为106PFU/ml。因此，制备的重组病毒完全能够满足后续实验的需求。为了满足后续试验对病毒的大量需求，制备的重组病毒通过L929细胞进行了传代扩增，并通过空斑实验检测其滴度，扩增得到的重组病毒滴度达到了108PFU/ml。由此可知，病毒滴度较高,达到了实验的要求。图1.3空斑检测L929细胞扩增的NBV-MB滴度A代表未加病毒的空白对照。B～G代表病毒稀释度分别依次为10-3～10-8。3.3病毒RNA垂直电泳检测分别提取重组病毒NBV-MB和野生NBV病毒RNA，进行SDS-PAGE垂直电泳，待电泳结束将SDS-PAGE凝胶浸入EtBr中，20min后通过凝胶成像系统观察，结果如图1.4所示，重组NBV-MB的10个条带清晰可见，出现大、中、小3类共10段条带：大基因组3条，中基因组3条和小基因组4条，与野生毒株NBV相比条带分布一致，这说明制备的重组病毒NBV-MB的RNA条带在数目和分布上都与野生毒株一致。


本文编号：3357311