基于ARTP和适应性进化选育高抗逆性凝结芽孢杆菌及其发酵豆粕的研究

发布时间：2021-08-27 00:58

　　凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是一种兼具乳酸菌和芽孢杆菌优势的益生菌,相比于其他菌群,其芽孢体对热、酸、碱、盐等不敏感,目前已成为饲料领域微生态制剂的优势菌种之一。然而,它在实际应用过程中常受到高温、低pH以及胆盐等多种环境胁迫,阻碍其发挥益生功能。因此,在前期从健康猪肠道内容物中分离纯化并鉴定出一株具有一定益生性的凝结芽孢杆菌WT-03的基础上,本研究利用常压室温等离子体诱变（Atmospheric and room temperature plasma,ARTP）结合适应性进化（Adaptive laboratory evolution,ALE）策略对其诱变,选育出耐酸、耐胆盐等抗逆性能明显改善的目的菌株;进而,从胞内pH变化、细胞结构及细胞膜多层面初步探究其抗逆性机制;最后,考察并优化其固态发酵豆粕的性能和发酵条件,对比发酵前后的豆粕营养品质,以期为提升豆粕发酵效率和产品品质等提供研究基础。主要研究内容有:（1）采用ARTP结合适应性进化选育了耐酸、耐胆盐的高抗逆性凝结芽孢杆菌。ARTP处理15 s后,凝结芽孢杆菌的致死率达到93.84%。利用含0.3%（w... 

【文章来源】：江苏大学江苏省

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

ARTP诱变及适应性进化流程示意

江苏大学硕士学位论文172.3.5适应性进化参考LeeJY等的方法对2.3.4.2中的菌株进行为期40天的摇瓶驯化实验[102]。驯化初始pH为5.0，依次降低，最终pH为2.5。按照2%的比例，将培养16h的复筛菌株种子液转接到初始MRS培养基中，37℃培养3d；依次转接至pH4.0、3.5、3.0和2.5的新鲜培养基中，如此不断转接，直至40d驯化结束。分别取第4d、9d、15d、24d以及40d的驯化细胞进行存活率测定，且进行三次平行实验，具体步骤如图2.1。图2.1ARTP诱变及适应性进化流程示意图.Fig2.1AflowdiagramofARTPmutagenesisandAdaptiveLabrotaryEvolution(ALE).图中各字母分别表示：A:B.coagulansWT-03的活化培养;B:诱变前的准备;C:ARTP诱变;D:0.3%胆盐平板初筛;E:24孔板耐酸性复筛;F:ARTP突变株的培养;G:ARTP突变株的适应性进化(ALE);H:进化突变株存活率的变化2.3.6抗逆性能评价参照Niederle等的方法[103]，采用体外胃肠道模拟消化系统对出发菌株和2.3.5中的突变株进行益生性评价。取1mL对数期菌液，转接到9mL模拟胃液中，混匀，37℃孵育3h；5000r/min、4℃离心10min，菌泥转移到相同体积的模拟肠液中，37℃孵育3h。整个过程中，每隔1h取适量菌液利用稀释平板涂布法计算存活率；且将存活率最高的菌株寄送至中国工业微生物菌种保藏中心进行寄存。2.3.7数据处理

基于ARTP和适应性进化选育高抗逆性凝结芽孢杆菌及其发酵豆粕的研究18所有实验均进行三次平行测定，实验数据利用EXCEL2010和Origin9.0进行处理并绘图，且结果以平均值±标准差（X±SD）表示。利用SPSS19.0软件进行统计分析，显著性水平为p<0.05。2.4结果与讨论2.4.1最佳诱变时间的确定为考察ARTP对B.coagulansWT-03细胞的杀伤程度，本实验根据诱变菌体在MRS平板上的存活率绘制时间-致死率效应关系图，如图2.2所示。图2.2ARTP诱变时间对B.coagulansWT-03致死率的影响Fig2.2RelationofARTPirradiationtimeandlethalrateontheB.coagulansWT-03从图2.2可以看出：与物理、化学等诱变方式不同的是，ARTP选育致死率--时间关系图呈“鞍型”[104]。一定时间范围内，致死率与照射时间成正相关，存活率与时间呈负相关。诱变时间为10s时，致死率为84.96%；照射时间的延长导致致死率的增加。15s时，致死率为93.84%；处理25s时，致死率达到99.42%，表明绝大部分细胞已死亡，这可能是因为ARTP产生的活性粒子造成细胞组织的损伤、引起细胞死亡。根据zhang等的研究，ARTP致死率在90%~95%时，正突变发生概率最高[105]。因此本实验选择15s作为最佳诱变时间。2.4.2ARTP突变菌株的筛选利用稀释平板涂布法将最佳诱变时间下的菌悬液涂布在胆盐筛选培养基上，根据生长情况，初步挑出30株可耐受0.3%（w/v）胆盐、生长态势良好的突变


本文编号：3365319