基于CRISPRi多基因组合抑制系统的建立及应用
发布时间：2021-09-01 07:49
通过调节关键酶的表达来优化代谢途径是提高代谢工程产物产量和产率的重要途径之一。微生物细胞工厂中通常有数百至数千个代谢反应,它们之间相互作用形成一个庞大且紧密联系的网络。因此,多基因的组合调控是必要的。实现组合调控的方法有很多,例如启动子优化,RBS优化,基因敲除,核糖开关控制等。这些方法需要基因工程来改变工程菌株的遗传信息,操作繁琐,难度较高。另外还有些不依靠基因重组的方法。例如依赖于Hfq的小RNA,反义RNA（asRNA）和RNAi等,通过阻碍mRNA翻译成蛋白质调节基因表达。但是,这些方法具有较为明显的脱靶和细胞毒性。最近,CRISPRi（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference）在基因调控领域引起了很多关注。CRISPRi仅需催化失活的Cas蛋白和嵌合单向导RNA（sgRNA）,就可以实现对特定基因表达的抑制,已经被用在越来越多的模型菌株和非模型菌株中,在重塑代谢途径,识别新的高效代谢酶及优化底盘细胞等方面发挥巨大的作用。已经有许多使用CRISPRi来同时调控多基因表达的应用,其...
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：88 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?ＤＮＡ结合的ＴＦｓ对启动子的调控机制［１３］??ＤＮＡ结合的ＴＦｓ?（阻遏物和激活物）与目标序列的亲和力是由一个或多个??２??
１?Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ?ｙ’??丄?ｐｒｏｍｏｔｅｒ?２?令?、?ｇｅｎｅ２?〇??＂ＣＪＨＥＳＩ＾??＾??：???１１１１１１１１１１?＇ｄ??〇Ｐｅｒ３ｔ〇ｒ２?＿＾Ｅ〇?—＾Ｃ〇?＾—ｄＣａｓ９???１?Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ?—ＴＥＤ?—ｉｒＤ??￣￣Ｌ?Ｐｒｏｍｏｔｅｒ?３?＾?＾?＾?〇??￣￣￣????１１１１１１１１１１１?ｌｉ?！：?１１１?ｉｔｔ??Ｗ?ｏｐｅｒａｔｏｒｓ?Ｗ?、?■１?＾ｌＯ?＝＊＂＾１〇?？｜｜＆＾〇??图１－３基于ＣＲＩＳＰＲｉ的多基因抑制系统的工作原理??首先使用三个诱导表达启动子构建了一个正交且严谨调控的多基因诱导表??达系统作为ｇＲＮＡ表达的平台。由于ＣＲＩＳＰＲｉ基因抑制系统高效且灵敏，少量??的ｇＲＮＡ表达就可以达到明显的抑制效果，这就对这个ｇＲＮＡ表达平台调控的??严谨性提出了极高的要求。因此在完成多基因诱导表达系统构建后需进一步优化??其严谨性，降低泄漏表达。接着对优化后的启动子的表达参数及正交性进行表征。??最后探究该表达系统在组合表达及时序表达时的能力，以提闻基于ＣＲＩＳＰＲｉ的??多基因抑制系统的应用潜力。??在完成在ｇＲＮＡ表达平台即多基因诱导表达系统的构建、优化及检测之后，??将其与ＣＲＩＳＰＲｉ基因抑制工具相结合，完成多基因抑制系统的构建，并检测其??抑制效果。之后通过突变ｇＲＮＡ骨架，降低ｇＲＮＡ与ｄＣａｓ９蛋白的亲和性的方??法，进一步提高系统严谨性，尽量消除ｇＲＮＡ泄漏表达造成的抑制。然后从ｇＲＮＡ??结合位点，ｓｐａｃｅｒ长度和诱导启动子等方面探宄影响ＣＲＩＳＰＲｉ抑制效果的因素。??最后以Ｎ－乙酰神经氨
制的多基因表达系统??３．１．１构建双质粒表达系统??使用ＣＲＩＳＰＲｉ基因调控工具对多个基因进行独立及组合调控的前提是使多??个靶向于不同目的基因的ｇＲＮＡ可以被独立的诱导表达，因此我们实验的第一??步是构建一个多基因诱导表达系统，作为ｇＲＮＡ的表达平台。该平台需要满足??两个基本要求，即基因表达调控必须严谨（无泄漏）且诱导表达时各启动子相互??之间无串扰。基于这些需求，我们设计了一个双质粒表达系统。首先选择了研宄??最深入应用最成熟的ｌａｃｌ，ｔｅｔＲ和ａｒａＣ用于构建系统。如图３－１所示，ＴＦｓ表达??质粒ｐ３ＴＦｓ－ｌａｃ丨以ＢＢＲ１为复制子，为抗性标记，三个ＴＦｓ表达基因（／此人??伙和和三个ＲＢＳ串联成基因簇，由一个组成型启动子ｐＪ２３１１８启动表??达。多基因表达质粒ｐＬＴＡｌ以Ｐ１５Ａ为复制子，办＾为抗性标记，含有三个诱导??表达启动子，分别为ｐｌａｃ，?ｐｔｅｔ和ｐｂａｄ，它们分别受ｌａｃｌ，ｔｅｔＲ和ａｒａＣ的调控，??并由诱导剂ＩＰＴＧ，ａＴｃ和Ａｒａ诱导表达。各启动子之间由不同的终止子间隔，??避免造成串联表达。当不存在诱导剂时，阻遏蛋白ｌａｄ和ｔｅｔＲ分别结合在ｐｌａｃ??和ｐｔｅｔ的操纵区ｌａｃＯ和ｔｅｔＯ上，阻碍ＲＮＡＰ与启动子结合起始转录。阻遏－激活??双功能蛋白ａｒａＣ在缺乏诱导剂Ａｒａ时也不具备激活转录的功能。当存在相应的??诱导剂时，ｌａｃｌ和ｔｅｔＲ与诱导剂结合变构，从启动子序列上解离下来，ＲＮＡＰ得??以与启动子结合。ａｒａＣ也与诱导剂结合变构，与ｐｂａｄ的操纵区ａｒａｌｉ和ａｒａｈ结??合并获得激活功能，与ＣＲＰ?—起招募ＲＮＡＰ起始转录。???ｒ＊＾?Ｌａｄ?？ＴｅｔＲ?－
本文编号：3376579
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：88 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?ＤＮＡ结合的ＴＦｓ对启动子的调控机制［１３］??ＤＮＡ结合的ＴＦｓ?（阻遏物和激活物）与目标序列的亲和力是由一个或多个??２??
１?Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ?ｙ’??丄?ｐｒｏｍｏｔｅｒ?２?令?、?ｇｅｎｅ２?〇??＂ＣＪＨＥＳＩ＾??＾??：???１１１１１１１１１１?＇ｄ??〇Ｐｅｒ３ｔ〇ｒ２?＿＾Ｅ〇?—＾Ｃ〇?＾—ｄＣａｓ９???１?Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ?—ＴＥＤ?—ｉｒＤ??￣￣Ｌ?Ｐｒｏｍｏｔｅｒ?３?＾?＾?＾?〇??￣￣￣????１１１１１１１１１１１?ｌｉ?！：?１１１?ｉｔｔ??Ｗ?ｏｐｅｒａｔｏｒｓ?Ｗ?、?■１?＾ｌＯ?＝＊＂＾１〇?？｜｜＆＾〇??图１－３基于ＣＲＩＳＰＲｉ的多基因抑制系统的工作原理??首先使用三个诱导表达启动子构建了一个正交且严谨调控的多基因诱导表??达系统作为ｇＲＮＡ表达的平台。由于ＣＲＩＳＰＲｉ基因抑制系统高效且灵敏，少量??的ｇＲＮＡ表达就可以达到明显的抑制效果，这就对这个ｇＲＮＡ表达平台调控的??严谨性提出了极高的要求。因此在完成多基因诱导表达系统构建后需进一步优化??其严谨性，降低泄漏表达。接着对优化后的启动子的表达参数及正交性进行表征。??最后探究该表达系统在组合表达及时序表达时的能力，以提闻基于ＣＲＩＳＰＲｉ的??多基因抑制系统的应用潜力。??在完成在ｇＲＮＡ表达平台即多基因诱导表达系统的构建、优化及检测之后，??将其与ＣＲＩＳＰＲｉ基因抑制工具相结合，完成多基因抑制系统的构建，并检测其??抑制效果。之后通过突变ｇＲＮＡ骨架，降低ｇＲＮＡ与ｄＣａｓ９蛋白的亲和性的方??法，进一步提高系统严谨性，尽量消除ｇＲＮＡ泄漏表达造成的抑制。然后从ｇＲＮＡ??结合位点，ｓｐａｃｅｒ长度和诱导启动子等方面探宄影响ＣＲＩＳＰＲｉ抑制效果的因素。??最后以Ｎ－乙酰神经氨
制的多基因表达系统??３．１．１构建双质粒表达系统??使用ＣＲＩＳＰＲｉ基因调控工具对多个基因进行独立及组合调控的前提是使多??个靶向于不同目的基因的ｇＲＮＡ可以被独立的诱导表达，因此我们实验的第一??步是构建一个多基因诱导表达系统，作为ｇＲＮＡ的表达平台。该平台需要满足??两个基本要求，即基因表达调控必须严谨（无泄漏）且诱导表达时各启动子相互??之间无串扰。基于这些需求，我们设计了一个双质粒表达系统。首先选择了研宄??最深入应用最成熟的ｌａｃｌ，ｔｅｔＲ和ａｒａＣ用于构建系统。如图３－１所示，ＴＦｓ表达??质粒ｐ３ＴＦｓ－ｌａｃ丨以ＢＢＲ１为复制子，为抗性标记，三个ＴＦｓ表达基因（／此人??伙和和三个ＲＢＳ串联成基因簇，由一个组成型启动子ｐＪ２３１１８启动表??达。多基因表达质粒ｐＬＴＡｌ以Ｐ１５Ａ为复制子，办＾为抗性标记，含有三个诱导??表达启动子，分别为ｐｌａｃ，?ｐｔｅｔ和ｐｂａｄ，它们分别受ｌａｃｌ，ｔｅｔＲ和ａｒａＣ的调控，??并由诱导剂ＩＰＴＧ，ａＴｃ和Ａｒａ诱导表达。各启动子之间由不同的终止子间隔，??避免造成串联表达。当不存在诱导剂时，阻遏蛋白ｌａｄ和ｔｅｔＲ分别结合在ｐｌａｃ??和ｐｔｅｔ的操纵区ｌａｃＯ和ｔｅｔＯ上，阻碍ＲＮＡＰ与启动子结合起始转录。阻遏－激活??双功能蛋白ａｒａＣ在缺乏诱导剂Ａｒａ时也不具备激活转录的功能。当存在相应的??诱导剂时，ｌａｃｌ和ｔｅｔＲ与诱导剂结合变构，从启动子序列上解离下来，ＲＮＡＰ得??以与启动子结合。ａｒａＣ也与诱导剂结合变构，与ｐｂａｄ的操纵区ａｒａｌｉ和ａｒａｈ结??合并获得激活功能，与ＣＲＰ?—起招募ＲＮＡＰ起始转录。???ｒ＊＾?Ｌａｄ?？ＴｅｔＲ?－
本文编号：3376579
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