AIFM2蛋白结构与功能的初步研究及c-di-AMP的酶法大量制备

发布时间：2021-09-03 11:30

　　第一部分（一）研究背景细胞凋亡是一种主动、有序、多基因调控的细胞逐渐死亡过程,是生命的基本现象之一。细胞凋亡大致可分为caspase依赖的和caspase非依赖的细胞凋亡两大类。目前,研究认为凋亡诱导因子AIF在caspase非依赖的细胞凋亡途径中起着关键作用。1.AIF是定位于线粒体膜间隙的黄素结合蛋白,其在特定的凋亡诱导信号刺激下,会从线粒体转移到核内从而引起染色质凝缩和DNA片段化。2.研究也发现与AIF同源的AIFM2（又名AMID）同样可以引起caspase非依赖的细胞凋亡。（1）AIFM2在结构上虽然与AIF相比缺失了线粒体定位序列片段,但是均具有与细菌氧化还原酶高度同源的NADH氧化还原酶区,可以结合一个FAD和一个NADH。（2）AIFM2大部分位于线粒体外膜,少数位于胞浆。虽然详细的机制还没有被研究清楚,已有的报道表明AIFM2对细胞核以及染色质的作用与AIF相似。另外bcl-2不能抑制AIFM2诱导的凋亡。为了探究AIFM2发挥生物学功能的结构基础和分子机制,我们对AIFM2进行了结构与功能的初步研究。（二）研究结果1.我们建立了AIFM2全长重组蛋白及突变体（含截... 

【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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图２－１坐滴法结晶板中单个密闭结晶小室示意图??

章实验结果??ＩＦＭ２全长蛋白表达纯化及功能初步研宄??蛋白分析??ＡＩＦＭ２蛋白是黄素结合蛋白，根据ＡＩＦ家族蛋白的特点，它应该至少两种小分子，即ＦＡＤ和ＮＡＤＨ。根据ＤＮＡｓｔａｒ软件对其组成的分析，长３７３个氨基酸，分子量４０．５ｋＤ，蛋白质等电点为９．１４。另外，该蛋个半胱氨酸，在纯化过程中可以考虑加还原型保护剂，防止蛋白聚用ＰｓｉＰｒｅｄ网站对其二级结构的预测。根据以上分析，我们考虑从表长蛋白入手，另外构建几个截短体。其中截短体包括２８－３７３?（截去Ｎ）和１－３１６?（截去Ｃ端Ｐ片区）。??

?山东大学硕士学位论文???３．１．２蛋白表达与纯化??在重组质粒ｐＥＴ２８ａ－ｓｕｍｏ－ＡＩＦＭ２测序正确的情况下，我们首先培养了?１?Ｌ的??菌并诱导表达。经镍柱纯化后的蛋白粗品呈黄绿色，见图３－２，应该结合有ＦＡＤ??分子。ＵＬＰ１蛋白酶切后的蛋白溶液依次进行Ｈｅｐａｒｉｎ柱和分子筛（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）??纯化，然后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测，详见图３－３和图３－４。结果显示过量表达且??用ＵＬＰ１蛋白酶切开后的蛋白条带与目的蛋白理论值４０．５?ｋＤ吻合，切掉的碎片与??ｓｕｍｏ标签蛋白大小（１８?ｋＤ）?—致，根据结果我们初步判断蛋白表达正常可以进??行后续实验。??．．


本文编号：3381032