限制性外切酶Ⅰ（EXO1）的合成、克隆与表达

发布时间：2021-10-05 16:46

　　【目的】核酸外切酶I （Exonuclease 1, EXO1）是一种多功能的3’→5’外切酶,主要应用于清除DNA或RNA双链分子中存在的单链。目前商品化的EXO1都是在大肠杆菌中诱导表达,表达量不高,且后续纯化步骤复杂。人工合成核酸外切酶I sbcB基因,并在大肠杆菌中高效表达及纯化。【方法】采用重叠PCR合成sbcB基因,通过酶切将其克隆至表达载体pET-30a上并转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,并对表达条件进行优化,获得限制性外切酶Ⅰ（EXO1）的大量表达。亲和层析纯化重组蛋白后对酶的活性进行研究。【结果】亲和纯化后获得大量表达蛋白EXO1,大小与预测的54.5 KD相符;以S1核酸外切酶为对照进行的功能验证证实:sbcB基因表达产物EXO1能够消化单链,但不会消化双链,纯化的EXO1具有很好的酶活性。【结论】依据本文方案制备的限制性外切酶Ⅰ（EXO1）产量高、纯度高,适用于实验室测序前PCR产物的处理。 

【文章来源】：西南农业学报. 2020,33(03)北大核心CSCD

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

sbcB基因序列

因目的基因总长1428 bp,为了提高合成成功率,分两段进行合成。目的基因的电泳检测结果如图2所示,sbcb(1～22)和sbcb(21～42)的理论值分别为785和791 bp。从图上可看出扩增的条带大小均在750～1000 bp之间,与预期理论值基本相符,可判断目的基因扩增成功。图3 重组表达载体菌落

重组表达载体菌落

【参考文献】：
期刊论文
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博士论文
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本文编号：3420139