miR-338-3p过表达/抑制表达慢病毒载体的构建及感染效率评价

发布时间：2021-10-07 23:48

　　目的:构建miR-338-3p过表达/抑制表达慢病毒载体,并检测其感染效率。方法:由miRBase数据库查找获得miR-338-3p前体序列,设计目的基因片段并人工合成;将miR-338-3p前体序列分别和p LVX-ZsGreen-miRNAPuro/p LVX-shRNA2-Puro载体进行双酶切反应后连接产生p LVX-ZsGreen-mmu-miR-338-Puro/p LVX-shRNA2-PuromiR-338-3p inhibitor慢病毒表达载体,测序鉴定,筛选阳性克隆。并感染293T细胞,包装产生慢病毒并测定滴度。通过荧光显微镜及流式细胞仪检测过表达/抑制表达miR-338-3p慢病毒感染RAW264. 7效率。结果:经过双酶切反应鉴定和测序证实,成功构建了miR-338-3p的慢病毒过表达/抑制表达载体p LVX-ZsGreen-mmu-miR-338-Puro/p LVX-shRNA2-Puro-miR-338-3p inhibitor,荧光显微镜下观察可见包装细胞293T表达绿色荧光。荧光显微镜及流式细胞检测技术提示,感染RAW264. 7破骨细胞系可获得稳定且... 

【文章来源】：临床口腔医学杂志. 2020,36(02)

【文章页数】：4 页

【部分图文】：

过表达/抑制表达载体质粒图谱

将含有目的基因的重组质粒p LVX-ZsGreen-mmu-miR-338-Puro、p LVX-shRNA2-Puro-miR-338-3p inhibitor分别导入293T细胞，产生含有目的基因的高滴度慢病毒。转染24 h后分别用荧光显微镜和倒置显微镜观察并拍照，结果发现有约80%的细胞可自发荧光(图2)，表明转染效果良好。48 h后收集病毒，利用倍比稀释法测定包装的两种病毒滴度，测得病毒滴度分别为3×108TU/m L,4×108TU/m L。2在RAW264.7细胞中有良好的感染效果

为了检测病毒在RAW264.7破骨细胞中的感染效果，将已包装好的过表达/干扰慢病毒转导入RAW264.7细胞中。48 h后采用荧光显微镜观察带绿色荧光信号的细胞，并拍照记录(图3)。图3 荧光显微镜下观察病毒感染RAW264.7细胞图(×100)

【参考文献】：
期刊论文
[1]慢病毒载体及其应用进展[J]. 褚波,黄雪峰,唐云明.  生物医学工程学杂志. 2008(01)



本文编号：3423019