MiR-22重组腺病毒的构建及对HepG2细胞葡萄糖摄取的影响

发布时间：2021-10-09 21:24

　　文中构建了miR-22重组腺病毒Ad-miR-22,分析了其对HepG2细胞胰岛素信号通路及葡萄糖摄取的抑制作用。通过PCR方法,扩增了miR-22的前体及侧翼序列,酶切后克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdT-22,经PCR及测序鉴定。穿梭质粒经PmeⅠ线性化后,直接转化含有腺病毒骨架载体的感受态细胞BJ5183,产生重组腺病毒质粒Ad-miR-22,最后经PacⅠ线性化后转染包装细胞系293A。重组腺病毒经过3轮扩增后感染HepG2细胞,通过荧光定量PCR检测miR-22表达水平。通过葡萄糖摄取实验观察Ad-miR-22对HepG2细胞葡萄糖摄取的影响。采用Western blotting检测Ad-miR-22对HepG2细胞SIRT1在蛋白质水平的表达及GSK-3β磷酸化水平的影响。采用荧光定量PCR检测miR-22对PEPCK及G6Pase等基因在mRNA水平表达的影响。结果表明,重组腺病毒Ad-miR-22感染显著增加HepG2细胞miR-22表达水平。此外,Ad-miR-22显著抑制胰岛素诱导的HepG2葡萄糖摄取,并通过下调GSK-3β磷酸化... 

【文章来源】：生物工程学报. 2020,36(04)北大核心CSCD

【文章页数】：9 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料及试剂
    1.2 质粒、菌株及细胞
    1.3 穿梭质粒及重组腺病毒质粒的构建
    1.4 重组腺病毒的包装和扩增
    1.5 荧光定量PCR
    1.6 葡萄糖摄取检测
    1.7 细胞糖原含量检测
    1.8 Western blotting
2 结果与分析
    2.1 构建重组穿梭质粒pAdT-22
    2.2 构建重组腺病毒过表达载体
    2.3 重组腺病毒颗粒的产生及大量扩增
    2.4 miR-22在HepG2细胞中的表达分析
    2.5 miR-22对肝细胞糖异生及葡萄糖摄取的抑制
    2.6 miR-22对肝细胞糖原合成的抑制
    2.7 miR-22对GSK-3β磷酸化及SIRT1蛋白质表达的抑制
3 讨论



本文编号：3427027