DEK43通过影响线粒体功能调控玉米籽粒发育

发布时间：2021-10-11 21:11

　　玉米籽粒作为主要的储能部位是玉米产量形成的基础,玉米籽粒发育机理的研究有助于玉米产量和品质性状的遗传改良。线粒体是植物细胞的能量工厂和进行有氧呼吸的主要场所,电子传递链是线粒体的产能核心,需要适当组装呼吸链复合物I-V才能发挥其功能,NADH脱氢酶4（nad4）基因编码线粒体呼吸链复合物I亚基IV。植物线粒体内含子为II型内含子,在翻译前需要剪接。PPR蛋白是细胞核编码的,参与细胞器基因表达的调控因子,包括细胞器RNA的编辑、内含子剪接、转录以及稳定性,其中P类PPR蛋白主要参与细胞器mRNA的剪接过程。本研究以玉米籽粒发育缺陷突变体defective kernel 43（dek43）为研究材料。dek43突变体表现出籽粒变小,粒重降低,胚胎致死,种皮颜色变浅等表型。组织切片分析发现,与同时期野生型相比,突变体籽粒胚和胚乳发育明显滞后,胚乳淀粉积累减少,且胚乳中部出现空腔。我们通过图位克隆技术去鉴定突变基因,在F₂代分离群体中共筛选了938个突变籽粒,通过12个分子标记,将基因定位在约900 Kb的区间内,该区间有28个基因,通过测序发现Zm00001d02105... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：87 页

【学位级别】：硕士

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缩略词说明
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 玉米籽粒的结构
        1.1.1 玉米籽粒的发育
        1.1.2 玉米胚的发育
        1.1.3 玉米胚乳的发育
        1.1.4 玉米dek籽粒突变体
    1.2 高等植物线粒体
        1.2.1 线粒体和氧化呼吸链
        1.2.2 线粒体是半自主细胞器
        1.2.3 线粒体内含子
        1.2.4 线粒体RNA的转录后修饰
    1.3 PPR蛋白家族
        1.3.1 PPR蛋白家族分布与进化
        1.3.2 PPR蛋白家族的分类
        1.3.3 PPR蛋白家族的功能
        1.3.4 PLS类 PPR蛋白的功能
        1.3.5 P类 PPR蛋白的功能
            1.3.5.1 线粒体P类 PPR蛋白促进RNA剪接
    1.4 本研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 玉米自交系材料
        2.1.2 菌株和质粒载体
        2.1.3 酶与生化试剂
        2.1.4 引物合成与测序
        2.1.5 培养基
    2.2 实验方法
        2.2.1 玉米材料种植与生长环境
        2.2.2 体视镜观察
        2.2.3 石蜡切片观察
        2.2.4 透射电镜观察
        2.2.5 玉米基因组DNA提取方法
            2.2.5.1 CTAB法提取玉米叶片基因组DNA
            2.2.5.2 CTAB法提取玉米籽粒基因组DNA
        2.2.6 PCR筛选多态性SSR分子标记
        2.2.7 PCR产物的检测
            2.2.7.1 50 ×TAE电泳母液配制
            2.2.7.2 4 %琼脂糖凝胶的配制及PCR产物的检测
        2.2.8 SSR分子标记的开发
        2.2.9 PCR扩增候选基因序列
        2.2.10 目的片段胶回收
        2.2.11 克隆载体的构建
        2.2.12 大肠杆菌感受态制备
        2.2.13 热激法转化大肠杆菌
        2.2.14 大肠杆菌的活化
        2.2.15 大肠杆菌菌落PCR鉴定
        2.2.16 DNA测序
        2.2.17 玉米总RNA的提取
            2.2.17.1 玉米籽粒总RNA的提取(CTAB法)
            2.2.17.2 玉米叶片总RNA的提取(Trizol法)
        2.2.18 反转录c DNA第一条链的合成
        2.2.19 实时荧光定量PCR
        2.2.20 半定量PCR
        2.2.21 亚细胞定位
            2.2.21.1 质粒大量提取纯化
            2.2.21.2 原生质体制备
        2.2.22 Western Blot检测
        2.2.23 线粒体复合物分析
            2.2.23.1 线粒体复合物提取
            2.2.23.2 线粒体复合物丰度分析
            2.2.23.3 线粒体复合物I活性分析
        2.2.24 序列连锁性分析
            2.2.24.1 CTAB法提取玉米籽粒基因组DNA
            2.2.24.2 突变位点PCR扩增
            2.2.24.3 电泳检测及测序
            2.2.24.4 序列连锁性分析
        2.2.25 等位杂交实验
3 结果与分析
    3.1 dek43 突变体表型分析
    3.2 遗传鉴定
    3.3 不同发育时期籽粒组织切片观察
    3.4 Dek43 的图位克隆
        3.4.1 多态性SSR分子标记的筛选
        3.4.2 Dek43 的初定位
        3.4.3 Dek43 的精细定位
    3.5 目的基因的确认
    3.6 Dek43 基因功能分析
        3.6.1 Dek43 基因的蛋白结构和表达模式
        3.6.2 DEK43 蛋白定位于细胞核和线粒体
        3.6.3 dek43 突变体中nad4 转录本第一个内含子和第三个内含子剪接效率下降
        3.6.4 dek43 突变体中呼吸链复合体I含量下降
        3.6.5 dek43 突变体透射电镜观察
        3.6.6 dek43 突变体中交替氧化呼吸途径相关基因表达量上升
        3.6.7 dek43 突变体转录组分析
4 讨论
    4.1 玉米DEK43 是一个定位于细胞核和线粒体的P类 PPR蛋白特异性参与了nad4 基因的剪接
    4.2 nad4 基因转录后加工对线粒体功能维持非常重要
    4.3 线粒体功能缺失显著影响籽粒发育
5 结论
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表的论文及成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]玉米胚乳发育研究进展[J]. 王晓燕,高荣岐,董树亭.  中国农学通报. 2005(06)
[2]玉米胚胎发育研究[J]. 洪宗宪,金惠芬,苟三启.  甘肃农业科技. 1983(03)

硕士论文
[1]植物PPR基因家族的鉴定与进化分析[D]. 宋学花.华南理工大学 2017



本文编号：3431247