甲羟戊酸途径限速步骤研究及其在产番茄红素重组大肠杆菌中的应用

发布时间：2021-10-22 05:08

　　甲羟戊酸途径（MVA途径）被引入重组大肠杆菌中,能够提高重组大肠杆菌中萜类化合物的合成能力。但因重组大肠杆菌中萜类化合物合成途径中间产物积累,导致细胞生长和萜类化合物合成受到限制。本研究在稳定表达MVA途径以及优化2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途径（MEP途径）、番茄红素合成途径关键基因表达的重组大肠杆菌LYC103中,用质粒高表达MVA途径和番茄红素合成途径关键基因,挖掘该途径的限速步骤。结果表明,ispA、crtE、mvaK1、idi和mvaD基因过表达后,细胞生长没有明显变化,番茄红素产量依次提高了13.5%、16.5%、17.95%、33.7%和61.1%,说明这几个基因可能是合成番茄红素的限速步骤。mvaK1、mvaK2、mvaD三个基因在同一操纵子上,用mRNA稳定区（RNA stabilizing region）进行启动子文库（mRSL）调控mvaK1,相当于对3个基因同时调控。用高效基因组编辑技术（CAGO）对mvaK1基因的mRNA稳定区进行启动子文库的调控,得到菌株LYC104。番茄红素产量与对照菌株LYC103相比增加了2倍,细胞生长提高了32%。然后,利用CR... 

【文章来源】：生物工程学报. 2020,36(01)北大核心CSCD

【文章页数】：13 页

【部分图文】：

LYC104构建流程图

通过将番茄红素合成基因过表达的形式来寻找番茄红素合成途径中的限速步骤。以pSC103质粒为模板扩增大小为5 kb的骨架，以LYC103菌株DNA基因组为模板，将mvaE、mvaS、mvaK1、mvaK2和mvaD基因以及idi、ispA和crtE基因进行PCR扩增，依次得到片段大小为2 412 bp、1 152 bp、879 bp、954 bp、1 011 bp、1 049 bp、900 bp和919 bp。核酸电泳图如图4所示。采用CPEC方法将单个基因连接到中pSC103质粒上，然后电转化菌株LYC103，取阳性单克隆用99A-F和扩增相应基因的下游引物进行菌落PCR，验证正确连接质粒。将PCR验证正确质粒送样测序，测序正确的质粒分别依照表1中的质粒名称进行命名。2.2 单基因过表达对番茄红素产量的影响

近年来，多个研究组对提高重组大肠杆菌中类胡萝卜素产量进行了研究，主要包括MEP途径研究[9-13]、中央代谢途径改造[14-18]、引入MVA途径增加前体物质供应[19-23]等几个方面。通过MVA途径增加萜类化合物前体物质供应，提高重组大肠杆菌类胡萝卜素产量已经有较为详细研究。Vadali等将MVA途径基因引入大肠杆菌，增加番茄红素合成前体物质IPP和DMAPP供应，番茄红素产量提高一倍[19]。Yoon等将MVA途径的后半部分几个基因引入大肠杆菌中，并通过增加MVA途径中间产物甲羟戊酸，成功提高番茄红素产量[20-21]。Anthony等发现MVA途径中甲羟戊酸激酶(MK)是一种限速酶[24]，通过改变限速基因启动子和质粒拷贝数，目标产物产量提高了7倍。但是，有研究表明甲羟戊酸途径酶表达不平衡可以抑制细胞生长[5,19]。Pitera等过表达MVA途径上游的几个基因，MVA途径中间体羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMGCo A)积累，抑制了细胞生长[5,25]。冯凡等将MVA途径分成3个代谢元件模块，并通过调控元件的表达来增强模块功能，从而使异戊二烯的产量得到提高[26]。Ye等将MVA途径分成两个模块在染色体上进行整合，并对两个模块建库调控，β-胡萝卜素产量提高了51%[23]。Wei等将MVA途径分成上下游两个模块基于染色体多位点整合策略，提高大肠杆菌合成番茄红素的产量[27]。Ye等构建MVA途径的乙酰辅酶A乙酰转移酶/HMG-CoA还原酶基因(mvaE)和mvaS基因等5个基因的RBS文库，根据菌株颜色，筛选到使β-胡萝卜素产量提高的质粒[22]。然后将得到协调表达的MVA途径基因整合到产番茄红素的重组大肠杆菌的染色体上，使番茄红素产量提高了1.19倍[5]。本研究对所得的LYC102菌株进行调控得到LYC103菌株[5,28]。LYC103菌株中MEP途径经过精确调控[13,18,29]，并且在染色体上含有完整的MVA途径基因[5,28]。MVA途径基因虽然经过RBS建库协调表达，但是可能因为本菌株是单拷贝的染色体表达，而Ye文献[22]中是多拷贝的质粒表达，并且本菌株MVA途径操纵子又经过了更换启动子的改造，所以MVA途径可能重新出现限速步骤。另外，在LYC103中添加了MVA途径，进一步增加了IPP/DMAPP的供应，下游也可能成为限速步骤，因此，确保整合MVA途径的菌株中前体物质的平衡供给，同时寻找并解除下游合成途径中的限速步骤。本研究首次在染色体整合完整MVA途径基因的基础上，将MVA途径中的5个基因进行研究，本方法优于对MVA途径5个基因同时进行研究。另外对番茄红素合成途径下游的异戊烯基焦磷酸异构酶(idi)、香叶醇转移酶(ispA)、GGPP合成酶基因(crtE)以单基因、多基因组合等方法在重组大肠杆菌中过量表达，从而寻找新的限速步骤，研究细胞生长和番茄红素产量的变化，并进一步提高番茄红素产量。

【参考文献】：
期刊论文
[1]稳定表达MVA途径基因提高番茄红素产量[J]. 李贞霞,陈倩倩,唐金磊,李清艳,张学礼.  生物工程学报. 2019(03)
[2]代谢工程改造甘油代谢途径提高β-胡萝卜素产量[J]. 董悦,胡坤乐,李兴林,李清艳,张学礼.  生物工程学报. 2017(02)
[3]提高大肠杆菌通过MVA途径合成异戊二烯[J]. 冯凡,许杨,陶勇,刘伟丰,林白雪.  生物工程学报. 2015(07)
[4]多个调控元件调控萜类合成途径基因表达提高β-胡萝卜素的生产[J]. 赵婧,刘怡,李清艳,朱欣娜,张学礼.  生物工程学报. 2013(01)

硕士论文
[1]番茄红素合成基因在大肠杆菌中的调控研究[D]. 陈倩倩.河南科技学院 2019



本文编号：3450444