二穗短柄草木栓质脂肪醇合成基因BdFAR4的功能研究
发布时间：2021-11-02 18:00
木栓质是由甘油、脂肪族、酚类化合物等组成的植物次生代谢产物,广泛存在于植物根部,也出现在表皮和周皮等部位,与地上部分存在的角质共同构成了植物为适应复杂环境变化而形成的疏水性屏障。木栓质与植物的多种抗性相关,对木栓质的研究有助于阐释植物抗性机理和提升植物抗性,然而目前相关的研究多集中于拟南芥中,其他物种中的报道较少。前期研究表明:二穗短柄草Bd FAR4基因在酵母及番茄中被证实参与木栓质初级脂肪醇的合成,但该基因详细的功能研究仍有待揭示。二穗短柄草是麦类作物重要的模式植物,对Bd FAR4的研究可为麦类作物的相关研究提供参考。本文在前人研究的基础上对Bd FAR4的功能展开了进一步研究分析。我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和过量表达技术结合二穗短柄草的遗传转化对Bd FAR4进行了功能验证;对Bd FAR4蛋白进行原核表达;通过亚细胞定位技术在拟南芥原生质体和烟草表皮细胞中确定了Bd FAR4蛋白的定位信息;对二穗短柄草进行了多种非生物胁迫处理,探究了Bd FAR4在各胁迫条件下的表达变化。本文的主要结论如下:1.CRISPR/Cas9系统成功编辑了二穗短柄草Bd21植株的Bd...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
技术路线图
第二章二穗短柄草BdFAR4基因的功能验证19图2-1BdFAR4基因结构及CRISPR/Csa9靶点示意图Fig.2-1SchematicofBdFAR4genestructureandCRISPR/Csa9target表2-6接头引物信息Table2-6Adapterprimerinformation引物名称引物序列U6a-gRNA-T1-F5’-GCCGAAGCTCTTCCTCTTGGTCC-3’U6a-gRNA-T1-R5’-AAACGGACCAAGAGGAAGAGCTT-3’U3-gRNA-T2-F5’-GGCATGTCGAATCGGCAAAGCTT-3’U3-gRNA-T2-R5’-AAACAAGCTTTGCCGATTCGACA-3’（2）gRNA表达盒的构建和扩增人工合成接头引物，用TE缓冲液稀释为100μM的母液，各取1μL加入98μL0.5×TE缓冲液混合，约90℃处理30s，随后在室温中冷却以完成退火。取U6a-gRNA，U3-gRNA载体质粒各0.5~1μL，在20μL反应体系中用5~10UBsaI酶切处理20min，70℃处理5min使酶失活，冷冻保存备用。酶切后的各载体与对应的接头在表2-7体系中室温连接10~20min以完成gRNA表达盒连接反应。表2-7连接反应体系Table2-7Ligationreactionsystem试剂用量（μL）10×T4buffer1.0gRNA载体0.5对应接头1.0ddH2O7.4T4连接酶0.1总体积10.0取2μL连接产物、KOD酶和各0.3μM的引物配制成15μLPCR体系各自进行第一轮扩增反应，引物使用1F：5’‐CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG‐3’；1R：5’‐CGGAGGAAAATTCCATCCAC‐3’。反应程序为：95℃1min，95℃15s、55℃
西北农林科技大学硕士学位论文26图2-2二穗短柄草愈伤组织诱导培养Fig.2-2CallusinductioncultureofB.distachyonA：培养初期；B、C：培养后期A:Earlyculture;B,C:Lateculture2.2.1.2愈伤组织的继代培养在诱导培养4周后，挑选鲜黄致密的愈伤组织进行继代培养，使愈伤块的数量增加。将未成熟胚诱导获得的鲜黄致密的大块愈伤组织分成许多愈伤小块，整齐摆放在新的愈伤诱导培养基上（图2-3A、B）。待小块愈伤组织长大后，可进行第二次继代培养，使愈伤组织的数量进一步增加。继代培养完成后，收集鲜黄致密的愈伤组织（图2-3C）进行农杆菌侵染。图2-3二穗短柄草愈伤组织继代培养Fig.2-3CallussubcultureofB.distachyonA、B：继代培养；C：鲜黄致密的愈伤组织A,B:Callussubculture;C:Brightyellowdensecallus2.2.1.3侵染后愈伤组织的筛选培养经过农杆菌侵染的愈伤组织进行共培养后转移到筛选培养基上进行筛眩潮霉素抗性基因是载体的报告基因，只有被成功转化后具有潮霉素抗性的愈伤组织才能在筛
【参考文献】：
期刊论文
[1]镉胁迫对盐芥根木栓质代谢的影响[J]. 陈宁美,欧阳舒毓,徐维烈,唐帅,韦善君,冯金朝,徐小静. 河南农业科学. 2018(10)
[2]CRISPR/Cas9基因编辑技术及在农作物品种改良研究中的应用[J]. 郝丽芬,房永雨,燕孟娇,皇甫海燕,宋培玲,贾晓清,皇甫九茹,李子钦,韩冰. 北方农业学报. 2017(03)
[3]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao. Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)
博士论文
[1]小麦超长链脂肪酰辅酶A还原酶基因TaFAR的同源克隆与功能分析[D]. 柴乖强.西北农林科技大学 2018
硕士论文
[1]二穗短柄草根中木栓质脂肪醇合成基因的克隆与功能验证[D]. 罗文巧.西北农林科技大学 2018
[2]CYP86A1在拟南芥响应干旱胁迫中的作用研究[D]. 高丽.兰州大学 2018
[3]二穗短柄草（Brachypodium distachyon）Bra1基因的克隆、表达特征分析及其基因编辑体系的建立[D]. 刘瑶瑶.江苏大学 2018
[4]小麦表皮蜡质β-酮脂酰辅酶A合成酶KCS基因的克隆与功能分析[D]. 夏凌峰.西北农林科技大学 2017
本文编号：3472162
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
技术路线图
第二章二穗短柄草BdFAR4基因的功能验证19图2-1BdFAR4基因结构及CRISPR/Csa9靶点示意图Fig.2-1SchematicofBdFAR4genestructureandCRISPR/Csa9target表2-6接头引物信息Table2-6Adapterprimerinformation引物名称引物序列U6a-gRNA-T1-F5’-GCCGAAGCTCTTCCTCTTGGTCC-3’U6a-gRNA-T1-R5’-AAACGGACCAAGAGGAAGAGCTT-3’U3-gRNA-T2-F5’-GGCATGTCGAATCGGCAAAGCTT-3’U3-gRNA-T2-R5’-AAACAAGCTTTGCCGATTCGACA-3’（2）gRNA表达盒的构建和扩增人工合成接头引物，用TE缓冲液稀释为100μM的母液，各取1μL加入98μL0.5×TE缓冲液混合，约90℃处理30s，随后在室温中冷却以完成退火。取U6a-gRNA，U3-gRNA载体质粒各0.5~1μL，在20μL反应体系中用5~10UBsaI酶切处理20min，70℃处理5min使酶失活，冷冻保存备用。酶切后的各载体与对应的接头在表2-7体系中室温连接10~20min以完成gRNA表达盒连接反应。表2-7连接反应体系Table2-7Ligationreactionsystem试剂用量（μL）10×T4buffer1.0gRNA载体0.5对应接头1.0ddH2O7.4T4连接酶0.1总体积10.0取2μL连接产物、KOD酶和各0.3μM的引物配制成15μLPCR体系各自进行第一轮扩增反应，引物使用1F：5’‐CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG‐3’；1R：5’‐CGGAGGAAAATTCCATCCAC‐3’。反应程序为：95℃1min，95℃15s、55℃
西北农林科技大学硕士学位论文26图2-2二穗短柄草愈伤组织诱导培养Fig.2-2CallusinductioncultureofB.distachyonA：培养初期；B、C：培养后期A:Earlyculture;B,C:Lateculture2.2.1.2愈伤组织的继代培养在诱导培养4周后，挑选鲜黄致密的愈伤组织进行继代培养，使愈伤块的数量增加。将未成熟胚诱导获得的鲜黄致密的大块愈伤组织分成许多愈伤小块，整齐摆放在新的愈伤诱导培养基上（图2-3A、B）。待小块愈伤组织长大后，可进行第二次继代培养，使愈伤组织的数量进一步增加。继代培养完成后，收集鲜黄致密的愈伤组织（图2-3C）进行农杆菌侵染。图2-3二穗短柄草愈伤组织继代培养Fig.2-3CallussubcultureofB.distachyonA、B：继代培养；C：鲜黄致密的愈伤组织A,B:Callussubculture;C:Brightyellowdensecallus2.2.1.3侵染后愈伤组织的筛选培养经过农杆菌侵染的愈伤组织进行共培养后转移到筛选培养基上进行筛眩潮霉素抗性基因是载体的报告基因，只有被成功转化后具有潮霉素抗性的愈伤组织才能在筛
【参考文献】：
期刊论文
[1]镉胁迫对盐芥根木栓质代谢的影响[J]. 陈宁美,欧阳舒毓,徐维烈,唐帅,韦善君,冯金朝,徐小静. 河南农业科学. 2018(10)
[2]CRISPR/Cas9基因编辑技术及在农作物品种改良研究中的应用[J]. 郝丽芬,房永雨,燕孟娇,皇甫海燕,宋培玲,贾晓清,皇甫九茹,李子钦,韩冰. 北方农业学报. 2017(03)
[3]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao. Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)
博士论文
[1]小麦超长链脂肪酰辅酶A还原酶基因TaFAR的同源克隆与功能分析[D]. 柴乖强.西北农林科技大学 2018
硕士论文
[1]二穗短柄草根中木栓质脂肪醇合成基因的克隆与功能验证[D]. 罗文巧.西北农林科技大学 2018
[2]CYP86A1在拟南芥响应干旱胁迫中的作用研究[D]. 高丽.兰州大学 2018
[3]二穗短柄草（Brachypodium distachyon）Bra1基因的克隆、表达特征分析及其基因编辑体系的建立[D]. 刘瑶瑶.江苏大学 2018
[4]小麦表皮蜡质β-酮脂酰辅酶A合成酶KCS基因的克隆与功能分析[D]. 夏凌峰.西北农林科技大学 2017
本文编号：3472162
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