lys1-d缺陷型标记介导毕赤酵母超高拷贝质粒整合

发布时间：2021-11-03 05:32

　　传统构建毕赤酵母质粒多拷贝菌株的方法不仅操作复杂、成本高,而且难以获得理想中的高拷贝菌株.近来,一种利用leu2-d缺陷型标记直接筛选毕赤酵母多拷贝克隆的方法显示出很大的便利.本研究发现,使用一个lys1-d缺陷型标记能更加高效地介导毕赤酵母超高拷贝质粒整合.首先构建一个携带lys1-d和EGFP（enhanced green fluorescent protein）报告基因的整合载体,然后将载体转化至敲除了内源lys1基因的毕赤酵母中,最后分别检测了转化子内EGFP含量和质粒拷贝数.结果显示,所有转化子整合的质粒拷贝数均处于19～168之间;并且转化子内质粒拷贝数越高,其胞内表达的EGFP产量也越高.这一系统为构建毕赤酵母超高拷贝质粒整合菌株增添了有效的工具. 

【文章来源】：湖北大学学报(自然科学版). 2020,42(05)

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

p GK1-lys1-d-EGFP载体图谱

将构建成功的pPpT4＿pHTX1-PARS1-hsCas9-LYS1gRNA质粒转化至毕赤酵母X33菌株，在含有终浓度为100 ng/μL博来霉素的YPD平板上生长3 d，任意挑取一个单菌落提取其基因组并测序．测序结果如图2A所示，可以看出在基因组上gRNA靶向位置发生“TA”双碱基缺失突变(将此突变株命名为XL1)．为了确认该菌株的表型，将其分别划线于MD和添加L-赖氨酸(终浓度0.04%)的MD培养基，结果显示(如图2B)，突变株无法在缺少L-赖氨酸的MD培养基上生长，证明lys1基因成功敲除．2.2 质粒整合

随即，又对这6个菌株表达外源蛋白的产量与整合的质粒拷贝数做了相关性分析．结果显示，这些菌株中质粒拷贝数与蛋白产量呈现显著的正相关性(如图5.R2>0.99)．从图中可以观察到整合了167.58个拷贝的Clone6，其荧光强度高达1 368 732，远远高于整合19.81个拷贝的Clone4的荧光强度100 318．这些结果表明，lys1-d缺陷型标记能有效地介导毕赤酵母超高拷贝质粒整合从而增加EGFP的表达．图4 PGK1启动子与met2基因拷贝数标准曲线


本文编号：3473149