利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得水稻OsMADS56基因突变体

发布时间：2021-11-05 20:54

　　OsMADS56是水稻中长日照下的开花抑制基因,与拟南芥中同时影响开花时间和花发育的SOC1同源。为了深入探究OsMADS56基因对水稻开花时间的调控功能,本研究利用反向遗传学的方法通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsMADS56基因设计了2个特异性敲除靶位点,构建了OsMADS56基因敲除载体,并通过农杆菌介导的转化方法成功获得了野生型粳稻9522背景的转基因苗。鉴定结果显示9棵OsMADS56转基因苗中包含了3种纯合突变类型,包括第一个外显子第45号碱基处缺失了一个G碱基、缺失了包含了第一个起始密码子的100个碱基对以及在第5个外显子第322号碱基处插入一个A碱基。通过蛋白序列比对分析,发现这三种类型的突变均造成移码突变和蛋白翻译提前终止引起保守结构域的缺失。本研究获得的水稻OsMADS56基因的三个突变体株系对今后进一步深入研究该基因的功能具有重要意义。 

【文章来源】：分子植物育种. 2020,18(11)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

OsMADS56基因的系统进化

在选择的OsMADS56基因的2个单敲除靶位点处分别设计引物，并将合成的引物退火合成目标片段。然后通过BsaⅠ酶切位点将目标片段连入pBIN-sgR-Cas9-Os载体中，然后将含有目标片段的CH载体连接到pCAMBIA1300载体上。通过PCR鉴定和测序确认载体构建成功后，分别命名为pBinOs MADS56-T1、p Bin-OsMADS56-T2。将构建成功的载体转入到农杆菌EHA105，再通过PCR鉴定筛选出含有阳性载体的农杆菌菌株，并侵染野生型水稻的愈伤组织。通过筛选培养、分化培养、生根培养得到成熟的水稻苗。提取叶片DNA，用鉴定引物(M13F和JD-M56-1R,M13F和JD-M56-2R)(表1)分别鉴定2个靶位点的植株是否携带了CRISPR/Cas9载体。用测序引物(JD-M56-1F和JD-M56-1R,JD-M56-2F和JD-M56-2R)(表1)分别对2个靶位点特异性敲除的转基因阳性植株进行PCR扩增，并将扩增片段测序确认靶位点序列变异。特异性鉴定引物扩增的片段长度分别为259 bp，野生型植株不能扩增出目的片段，电泳结果显示T0代5株苗为转基因植株pBin-OsMADS56-T1-9522,4株苗为转基因植株pBin-OsMADS56-T2-9522(图4)。图3 OsMADS56基因的结构及g RNA靶位点位置

OsMADS56基因的结构及g RNA靶位点位置

【参考文献】：
期刊论文
[1]OsMADS34与OsMADS56蛋白互作及OsMADS56表达模式分析[J]. 李晓峰,张大兵.  基因组学与应用生物学. 2018(04)
[2]利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得水稻OsYUCCA1基因突变体[J]. 何先畅,黄国强,王道洋,常淑伟,张大兵.  基因组学与应用生物学. 2017(11)



本文编号：3478495