G3BP1促进胞质DNA感受器cGAS介导的抗病毒免疫
发布时间：2021-11-12 11:47
天然免疫系统是机体抵抗病原体感染的第一道防线。在长期与病原体的斗争中,天然免疫系统进化出了一系列模式识别受体,能够识别各种病原体特有的“异己”信号,迅速地激活机体的天然免疫反应。cGAS（Cyclic GMPAMP synthase）作为一种关键的模式识别受体,能够识别一种特殊的“异己”信号——DNA。在正常情况下,DNA被严格地限制在细胞核或线粒体这样的结构内与胞质隔离,只有当病原体感染或细胞损伤时,DNA才会出现在胞质中,进而被细胞视为“异己”信号并启动免疫应答。cGAS在识别并结合胞浆DNA后会发生构象改变,并迅速催化ATP和GTP合成环二核苷酸cGAMP（Cyclic GMP-AMP）。cGAMP作为信号转导的第二信使,进而结合并激活接头蛋白质STING及下游信号通路,引起转录因子IRF3活化,启动Ⅰ型干扰素表达,帮助宿主进行免疫防御。cGAS能够识别不同病原体来源DNA,其对DNA的结合不依赖特征性序列。这样一种广泛的识别作用也导致cGAS能够识别自身的DNA,cGAS的异常激活参与了包括自身免疫病在内的多种疾病发生。因此,对cGAS功能的精确调控能够帮助机体在维持稳态的同时...
【文章来源】：军事科学院北京市
【文章页数】：104 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
1质谱鉴定得到与cGAS有潜在相互作用的高分值候选蛋白质
军事科学院博士学位论文第41页2.1.2.G3BP1对DNA激活的I型干扰素生成具有重要促进作用为了评价G3BP1对cGAS信号通路的调控作用，我们首先利用CRISPR／Cas9技术在U937细胞中敲除了G3BP1，并分别检测了野生型（WT）以及G3BP1敲除（G3BP1–/–）的U937细胞中G3BP1的敲除效果以及cGAS信号通路的完整性（图2.1.2a，右），我们发现敲除G3BP1不影响cGAS信号通路中关键蛋白质的表达。我们进一步通过转染DNA模拟外源DNA侵入细胞的过程。我们用2g/ml的HT-DNA刺激细胞，12小时后通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测I型干扰素IFN-的释放。结果显示，与WT细胞相比，G3BP1敲除的U937细胞在HT-DNA刺激下产生的IFN-明显减少（图2.1.2a，左）。ELISA检测数值以均值±均值标准误差表示，***P<0.001，双尾t检验，N.D.（non-detected）表示未检测到。-actin为内参蛋白质。图2.1.2aU937细胞中敲除G3BP1，显著抑制HT-DNA诱导的IFN-释放我们又尝试以不同浓度的HT-DNA分别刺激两种细胞，2小时后利用Trizol裂解细胞，提取细胞总RNA，并通过定量PCR（qPCR）分析I型干扰素基因IFNB的转录变化（图2.1.2b）。qPCR检测数值以均值±均值标准误差表示，**P<0.01，***P<0.001，双尾t检验。我们发现与ELISA结果一致，敲除G3BP1显著抑制HT-DNA导致的IFNB转录。尽管随着HT-DNA刺激浓度增加（至饱和程度），敲除G3BP1带来的抑制效应在一定程度上有所补偿，但其激活程度仍明显弱于同样刺激浓度下WT组IFNB的转录水平。图2.1.2bU937细胞中敲除G3BP1，显著抑制不同浓度HT-DNA诱导的IFNB转录
军事科学院博士学位论文第41页2.1.2.G3BP1对DNA激活的I型干扰素生成具有重要促进作用为了评价G3BP1对cGAS信号通路的调控作用，我们首先利用CRISPR／Cas9技术在U937细胞中敲除了G3BP1，并分别检测了野生型（WT）以及G3BP1敲除（G3BP1–/–）的U937细胞中G3BP1的敲除效果以及cGAS信号通路的完整性（图2.1.2a，右），我们发现敲除G3BP1不影响cGAS信号通路中关键蛋白质的表达。我们进一步通过转染DNA模拟外源DNA侵入细胞的过程。我们用2g/ml的HT-DNA刺激细胞，12小时后通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测I型干扰素IFN-的释放。结果显示，与WT细胞相比，G3BP1敲除的U937细胞在HT-DNA刺激下产生的IFN-明显减少（图2.1.2a，左）。ELISA检测数值以均值±均值标准误差表示，***P<0.001，双尾t检验，N.D.（non-detected）表示未检测到。-actin为内参蛋白质。图2.1.2aU937细胞中敲除G3BP1，显著抑制HT-DNA诱导的IFN-释放我们又尝试以不同浓度的HT-DNA分别刺激两种细胞，2小时后利用Trizol裂解细胞，提取细胞总RNA，并通过定量PCR（qPCR）分析I型干扰素基因IFNB的转录变化（图2.1.2b）。qPCR检测数值以均值±均值标准误差表示，**P<0.01，***P<0.001，双尾t检验。我们发现与ELISA结果一致，敲除G3BP1显著抑制HT-DNA导致的IFNB转录。尽管随着HT-DNA刺激浓度增加（至饱和程度），敲除G3BP1带来的抑制效应在一定程度上有所补偿，但其激活程度仍明显弱于同样刺激浓度下WT组IFNB的转录水平。图2.1.2bU937细胞中敲除G3BP1，显著抑制不同浓度HT-DNA诱导的IFNB转录
本文编号：3490850
【文章来源】：军事科学院北京市
【文章页数】：104 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
1质谱鉴定得到与cGAS有潜在相互作用的高分值候选蛋白质
军事科学院博士学位论文第41页2.1.2.G3BP1对DNA激活的I型干扰素生成具有重要促进作用为了评价G3BP1对cGAS信号通路的调控作用，我们首先利用CRISPR／Cas9技术在U937细胞中敲除了G3BP1，并分别检测了野生型（WT）以及G3BP1敲除（G3BP1–/–）的U937细胞中G3BP1的敲除效果以及cGAS信号通路的完整性（图2.1.2a，右），我们发现敲除G3BP1不影响cGAS信号通路中关键蛋白质的表达。我们进一步通过转染DNA模拟外源DNA侵入细胞的过程。我们用2g/ml的HT-DNA刺激细胞，12小时后通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测I型干扰素IFN-的释放。结果显示，与WT细胞相比，G3BP1敲除的U937细胞在HT-DNA刺激下产生的IFN-明显减少（图2.1.2a，左）。ELISA检测数值以均值±均值标准误差表示，***P<0.001，双尾t检验，N.D.（non-detected）表示未检测到。-actin为内参蛋白质。图2.1.2aU937细胞中敲除G3BP1，显著抑制HT-DNA诱导的IFN-释放我们又尝试以不同浓度的HT-DNA分别刺激两种细胞，2小时后利用Trizol裂解细胞，提取细胞总RNA，并通过定量PCR（qPCR）分析I型干扰素基因IFNB的转录变化（图2.1.2b）。qPCR检测数值以均值±均值标准误差表示，**P<0.01，***P<0.001，双尾t检验。我们发现与ELISA结果一致，敲除G3BP1显著抑制HT-DNA导致的IFNB转录。尽管随着HT-DNA刺激浓度增加（至饱和程度），敲除G3BP1带来的抑制效应在一定程度上有所补偿，但其激活程度仍明显弱于同样刺激浓度下WT组IFNB的转录水平。图2.1.2bU937细胞中敲除G3BP1，显著抑制不同浓度HT-DNA诱导的IFNB转录
军事科学院博士学位论文第41页2.1.2.G3BP1对DNA激活的I型干扰素生成具有重要促进作用为了评价G3BP1对cGAS信号通路的调控作用，我们首先利用CRISPR／Cas9技术在U937细胞中敲除了G3BP1，并分别检测了野生型（WT）以及G3BP1敲除（G3BP1–/–）的U937细胞中G3BP1的敲除效果以及cGAS信号通路的完整性（图2.1.2a，右），我们发现敲除G3BP1不影响cGAS信号通路中关键蛋白质的表达。我们进一步通过转染DNA模拟外源DNA侵入细胞的过程。我们用2g/ml的HT-DNA刺激细胞，12小时后通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测I型干扰素IFN-的释放。结果显示，与WT细胞相比，G3BP1敲除的U937细胞在HT-DNA刺激下产生的IFN-明显减少（图2.1.2a，左）。ELISA检测数值以均值±均值标准误差表示，***P<0.001，双尾t检验，N.D.（non-detected）表示未检测到。-actin为内参蛋白质。图2.1.2aU937细胞中敲除G3BP1，显著抑制HT-DNA诱导的IFN-释放我们又尝试以不同浓度的HT-DNA分别刺激两种细胞，2小时后利用Trizol裂解细胞，提取细胞总RNA，并通过定量PCR（qPCR）分析I型干扰素基因IFNB的转录变化（图2.1.2b）。qPCR检测数值以均值±均值标准误差表示，**P<0.01，***P<0.001，双尾t检验。我们发现与ELISA结果一致，敲除G3BP1显著抑制HT-DNA导致的IFNB转录。尽管随着HT-DNA刺激浓度增加（至饱和程度），敲除G3BP1带来的抑制效应在一定程度上有所补偿，但其激活程度仍明显弱于同样刺激浓度下WT组IFNB的转录水平。图2.1.2bU937细胞中敲除G3BP1，显著抑制不同浓度HT-DNA诱导的IFNB转录
本文编号：3490850
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