C18同源模板介导基因敲入的研究与优化
发布时间：2021-11-20 03:06
基因敲入技术主要是利用人为导入基因修复所依赖的同源序列,借助细胞自身的DNA同源重组修复机制,实现外源基因的定点插入。新一代CRISPR/Cas9基因编辑技术是一种操作简便、精度较好、效率较高、安全性较好的基因敲入、敲除、修饰技术,目前主要通过以下5种方式介导基因的靶向整合,即同源重组（homologous recombination,HR）、微同源末端连接（Microhomology-mediated end joining,MMEJ）、非同源末端连接（Non-homologous end joining,NHEJ）、同源末端连接（Homology-mediated end joining,HMEJ）以及单链DNA（Single-stranded oligodeoxynucleotides,ss ODNs）。本研究利用Spacer18（C18）能与核苷酸链相连接的特点,开发出C18同源模板介导基因敲入的新方法,通过设计含有C18的单链核苷酸引物,以敲入基因为模板,利用PCR产生两端含有黏性末端的C18同源模板。基于此,对C18同源模板、HR、MMEJ、NHEJ、HMEJ以及ss OD...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Cas9PAM序列及引入DSB的位置（Komoretal,2017）
种基因敲入方法示意图（Yaoetal,2017a）
第二章6种基因敲入方法的效率比较152.2试验方法2.2.1sgRNA表达载体的构建2.2.1.1sgRNA的设计从NCBI上选取小鼠GAPDH基因（GeneID:14433）的3’UTR序列，利用在线sgRNA设计工具（http://crispr.mit.edu/），满足PAM序列为NGG的基本条件，根据评分和位置选择4426-4445处CAGGGTTTCTTACTCCTTGG为本试验的sgRNA，然后设计退火引物，在退火引物上游5’端加accg序列，在下游添加aaac序列，将设计好的序列发送给西安擎科生物有限公司合成。将得到的引物稀释到100μM，保存于4℃冰箱。2.2.1.2U6-sgRNA载体构建（1）PGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin载体酶切线性化。该载体用于真核表达，且在317和342位置具有BsaI酶切位点，质粒图谱如图2-2所示。图2-2PGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin载体图谱Fig.2-2PGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycinplasmidvector使用BsaI酶对该载体质粒进行酶切，酶切体系如下：成分用量PGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin质粒10μgCutSmartBuffer5μLBsaI1μLddH2OTo50μL以上各成分混匀后于37℃恒温水浴锅中过夜酶切，根据环状质粒与线性化质粒在琼脂糖凝胶电泳的迁移率不同，利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分；用Cycle-PureKit（Omega）试剂盒回收酶切后的线性化质粒。（2）将公司合成的sgRNAoligo单链引物稀释至100μM，使用PCR仪进行退火，退火后形成带有粘性末端的双链。得到的双链sgRNA的粘性末端与BsaI酶切后线性
本文编号：3506439
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Cas9PAM序列及引入DSB的位置（Komoretal,2017）
种基因敲入方法示意图（Yaoetal,2017a）
第二章6种基因敲入方法的效率比较152.2试验方法2.2.1sgRNA表达载体的构建2.2.1.1sgRNA的设计从NCBI上选取小鼠GAPDH基因（GeneID:14433）的3’UTR序列，利用在线sgRNA设计工具（http://crispr.mit.edu/），满足PAM序列为NGG的基本条件，根据评分和位置选择4426-4445处CAGGGTTTCTTACTCCTTGG为本试验的sgRNA，然后设计退火引物，在退火引物上游5’端加accg序列，在下游添加aaac序列，将设计好的序列发送给西安擎科生物有限公司合成。将得到的引物稀释到100μM，保存于4℃冰箱。2.2.1.2U6-sgRNA载体构建（1）PGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin载体酶切线性化。该载体用于真核表达，且在317和342位置具有BsaI酶切位点，质粒图谱如图2-2所示。图2-2PGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin载体图谱Fig.2-2PGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycinplasmidvector使用BsaI酶对该载体质粒进行酶切，酶切体系如下：成分用量PGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin质粒10μgCutSmartBuffer5μLBsaI1μLddH2OTo50μL以上各成分混匀后于37℃恒温水浴锅中过夜酶切，根据环状质粒与线性化质粒在琼脂糖凝胶电泳的迁移率不同，利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分；用Cycle-PureKit（Omega）试剂盒回收酶切后的线性化质粒。（2）将公司合成的sgRNAoligo单链引物稀释至100μM，使用PCR仪进行退火，退火后形成带有粘性末端的双链。得到的双链sgRNA的粘性末端与BsaI酶切后线性
本文编号：3506439
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