基于纳米抗体的Fenobody和RANbody禽新城疫病毒夹心ELISA检测方法的建立

发布时间：2022-01-08 23:46

　　新城疫（Newcastle Disease,ND）由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）感染引起的禽的高度接触性传染病。该病主要导致禽类呼吸困难、神经紊乱、黏膜出血、排绿色稀便。其感染性强、死亡率高,给全球养禽业造成巨大的经济损失。由于ND的临床症状易与禽流感、传染性支气管炎和传染性喉气管炎等其它家禽呼吸系统疾病混淆,因此,高效简易地能够将ND与其它呼吸系统疾病鉴别诊断的技术研发迫在眉睫。目前,ELISA检测方法已应用于NDV的检测,该方法具有操作简单、快速检测、特异性高等优点,但是由于商品化生产成本高、难以长期保存等缺点限制了其临床上的广泛应用。纳米抗体（Nanobody）是骆驼科体内特有的一种天然缺失轻链和重链第一恒定区的特殊Ig G。纳米抗体可以通过基因工程技术进行修饰而不改变其与抗原的结合特性,易于在不同系统中表达,并能够与多种标签融合表达,从而为疾病诊断提供一种简单、有效的检测方法。近年来,从纳米抗体衍生出的fenobody（铁蛋白融合的纳米抗体）和RANbody（纳米抗体融合报告基因）,已用于疫病免疫诊断方法的建立。但是,关于使用fenobo... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：96 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

NDV结构示意图(Belloetal.2018)

第一章文献综述7外，CDR1区的Cys残基可以和CDR3形成使抗原结合位点稳定的二硫键(Muyldermansetal.1994;Vuetal.1997)。VHH分子尺寸小于15kDa，尺寸在纳米范围内（直径约2.5nm，高度约4nm），也被称为纳米抗体（Nb，nanobody）(Sheriffetal.1996)。体积小，可迅速穿透炎症，并易通过分子基因编辑技术对其进行修饰(Zhangetal.2004)。此外，由于在FR2中有亲水氨基酸残，能够使VHHs的溶解度显著增加。体积孝可变性、稳定性、亲和性和溶解性等优点使VHHs成为免疫治疗的理想工具。图1-2纳米抗体结构图[引自(Iezzietal.2018)]Figure1-2Nanobodystructure[quotedfrom(Iezzietal.2018)]1.2.2纳米抗体的应用1.2.2.1纳米抗体在科学研究中的应用作为亲和捕获试剂，VHH被应用于蛋白质构象、生物分子相互作用、重组蛋白纯化和细菌检测等方面的研究(Lietal.2018)。VHH可作为靶向药物载体，提高药物治疗效果。VHH脂质体与表皮生长因子受体（EGFR）结合，下调表皮因子受体的表达，从而抑制肿瘤的生长(Salemaetal.2016)。VHH作为靶向效应域，VHH与融合蛋白结合形成特定的治疗区域(如酶或毒素)，进入靶细胞，增强治疗效果。非洲锥虫具有卵裂活性。抗布锥虫的VHHs与人类截尾锥虫融合用于治疗非洲人类锥形虫(Lietal.2018)。1.2.2.2纳米抗体在疾病诊断的应用HER2（人表皮生长因子受体-2）是一种与乳腺癌相关的肿瘤标志物。Vancycken等人(D"Huyvetteretal.2014)筛选了38个标记为HER2受体的VHHs，通过对HER2靶向的Ga-NbPET的显像，对健康及乳腺癌患者进行安全性评价。VHHs已被成功用于家畜布鲁氏菌和耶尔森氏菌感染的区分，而单克隆抗体却未能成功区分(Even-Desrumeauxetal.2010)。类似地，用于检测猪带绦虫病感染的种属特异性VHHs补充了现有的种属特异性单克

幸源炕?腘DV颗粒作为抗原筛选纳米抗体的报道。本章主要内容包括NDVLaSota灭活疫苗株对骆驼的免疫、抗NDV纳米抗体噬菌体展示文库的构建、纯化的NDV颗粒筛选特异性纳米抗体、测序鉴定，最终获得13株NDV特异性纳米抗体。2.1材料2.1.1质粒、菌株、毒株、疫苗与实验动物pMECS噬菌体展示载体为实验室种子库保存，M13KO7辅助噬菌体购自NEB，E.coliTG1感受态购自Beyotime（江苏碧云天），NDVLaSota灭活疫苗购自河南普莱克公司，成年雄性双峰驼购自甘肃省民勤，SPF鸡胚购于山东浩泰生物，NDVLaSota毒株为实验室种子库保存。图2-1噬菌体展示载体（pMECS）图谱和多克隆酶切位点(Vinckeetal.2012)Figure2-1MapofpMECSphagevectorandMCS(Vinckeetal.2012)

【参考文献】：
期刊论文
[1]鉴别新城疫强、弱毒一步RT-PCR方法的建立及应用[J]. 明文龙,尹仁福,谢光耀,薛聪,王珂,袁乾亮,丁壮.  中国兽医学报. 2015(07)
[2]新城疫病毒纯化方法的比较研究[J]. 余祖华,丁轲,朱巧艳.  河南农业科学. 2010(09)
[3]新城疫及其检测方法研究进展[J]. 刘怀然,孔宪刚.  畜牧兽医科技信息. 2008(10)
[4]新城疫病毒的基因组与结构蛋白特征[J]. 程相朝.  河南科技大学学报(农学版). 2004(01)
[5]用胶体金免疫电镜技术检测新城疫病毒[J]. 薛拥志,孙继国,甘永华,王连荣.  河北农业大学学报. 2003(S1)
[6]ND La Sota毒种在SPF鸡胚中增殖规律初探[J]. 王宝玲.  中国兽药杂志. 2002(07)

博士论文
[1]新城疫病毒HN蛋白纳米抗体的筛选及功能研究[D]. 高小龙.西北农林科技大学 2016

硕士论文
[1]陕西省鸡新城疫流行情况的病原学检测及其免疫效果分析[D]. 刘浩.西北农林科技大学 2014
[2]新城疫病毒F基因在真核及原核表达系统中的表达[D]. 王青.西北农林科技大学 2007



本文编号：3577507