Rab GTPase蛋白家族在线粒体自噬中的功能性研究
发布时间：2022-01-10 20:47
真核细胞通过选择性自噬,特异性地清除受损的细胞器、错误折叠的蛋白聚集体或入侵的病原体等自噬底物,从而维持细胞内环境的稳态。与非选择性自噬不同,选择性自噬通过底物受体蛋白确保特定底物的识别、隔离和包裹,以便于随后的溶酶体降解。然而,选择性自噬过程中自噬体形成的时空调控机制尚不清晰。基于我们前期的研究结果,我们提出科学假设:Rab GTPase蛋白通过与底物受体蛋白的相互作用,调控选择性自噬的起始以及自噬体的靶向性发生。Rab GTPase蛋白广泛分布于细胞内膜系统中,在囊泡运输和融合等过程中发挥重要作用。我们发现人类的Rab GTPase蛋白家族普遍存在自噬性降解,这种现象类似于II型LC3和底物受体蛋白的降解。进一步的研究发现,能够被自噬性降解的Rab GTPase蛋白与受体蛋白存在相互作用。我们以线粒体自噬作为验证模型,发现16个Rab GTPase蛋白被招募到去极化的线粒体上,我们还发现这些Rab GTPase的内源性蛋白在线粒体自噬诱导条件下发生自噬性降解。更重要的是,过表达Rab GTPase蛋白能够促进线粒体自噬的发生,而Rab GTPase蛋白的缺失则会抑制线粒体自噬。机制...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
自噬性GFP酶解实验
浙江大学硕士学位论文引言31.1）。图1.1筛选过程示意图。为了便于理解整个筛选过程，以下通过举例简要阐述筛选原理。自噬性GFP酶解实验由于GFP在溶酶体中的稳定性相对较高，因此带有GFP标签的蛋白进入溶酶体后会产生游离的GFP，后者可以利用western-blot检测到。在诱导自噬后，处理组游离GFP水平若显著高于对照组，则该蛋白存在自噬性降解的可能。如图1.2所示，Rab1、Rab2、Rab3、Rab4和Rab5在25kDa处存在明显的GFP片段条带且处理组显著高于对照组，而RabL4则无此现象，因此我们排除了RabL4。通过这一轮筛选，我们发现44个Rabs中有31个存在GFP酶解现象。图1.2自噬性GFP酶解实验。构建GFP-Rabs表达质粒，在HEK293T细胞中瞬时表达GFP-Rabs蛋白，24h后对照组使用DMSO处理2h，处理组使用Torin1（50nM）处理2h。自噬阻断时GFP酶解实验
浙江大学硕士学位论文引言4在自噬过程中，Atg7作为一种与泛素激活酶E1具有同源性的自噬相关蛋白，对于自噬体的形成极为关键，当细胞缺乏Atg7时，一般认为细胞自噬被完全阻断。当自噬被阻断后，GFP-Rabs若无法被有效酶解，则进一步说明其存在自噬性降解。因此我们使用Atg7-/-HEK293细胞重复了上述自噬性GFP酶解实验。如图1.3所示，当自噬被阻断，Rab1、Rab2、Rab3、Rab14和Rab18无法形成明显的GFP片段条带，而Rab17可以，因此我们排除了Rab17。通过这一轮筛选，我们发现28个RabGTPase蛋白在Atg7缺失时无法被有效酶解。图1.3自噬阻断时GFP酶解实验。使用GFP-Rabs表达质粒，在Atg7-/-HEK293细胞中瞬时表达GFP-Rabs蛋白，24h后对照组使用DMSO处理2h，处理组使用Torin1（50nM）处理2h。自噬诱导后mCherry-GFP-Rab荧光检测相较于mCherry，GFP的荧光信号在溶酶体的酸性环境中更容易淬灭，因此通过构建mCherry-GFP-Rabs质粒在U2OS细胞表达相应蛋白，在荧光显微镜下进行观察。若GFP和mCherry的荧光信号出现重叠（黄色），则代表该蛋白不在溶酶体相关囊泡内；而如果出现单独的mCherry荧光信号（红色），则代表该蛋白在溶酶体相关囊泡内（DanielJ.Klionskyetal.,2007）。如图1.4所示，图中Rab6、Rab8
本文编号：3581392
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
自噬性GFP酶解实验
浙江大学硕士学位论文引言31.1）。图1.1筛选过程示意图。为了便于理解整个筛选过程，以下通过举例简要阐述筛选原理。自噬性GFP酶解实验由于GFP在溶酶体中的稳定性相对较高，因此带有GFP标签的蛋白进入溶酶体后会产生游离的GFP，后者可以利用western-blot检测到。在诱导自噬后，处理组游离GFP水平若显著高于对照组，则该蛋白存在自噬性降解的可能。如图1.2所示，Rab1、Rab2、Rab3、Rab4和Rab5在25kDa处存在明显的GFP片段条带且处理组显著高于对照组，而RabL4则无此现象，因此我们排除了RabL4。通过这一轮筛选，我们发现44个Rabs中有31个存在GFP酶解现象。图1.2自噬性GFP酶解实验。构建GFP-Rabs表达质粒，在HEK293T细胞中瞬时表达GFP-Rabs蛋白，24h后对照组使用DMSO处理2h，处理组使用Torin1（50nM）处理2h。自噬阻断时GFP酶解实验
浙江大学硕士学位论文引言4在自噬过程中，Atg7作为一种与泛素激活酶E1具有同源性的自噬相关蛋白，对于自噬体的形成极为关键，当细胞缺乏Atg7时，一般认为细胞自噬被完全阻断。当自噬被阻断后，GFP-Rabs若无法被有效酶解，则进一步说明其存在自噬性降解。因此我们使用Atg7-/-HEK293细胞重复了上述自噬性GFP酶解实验。如图1.3所示，当自噬被阻断，Rab1、Rab2、Rab3、Rab14和Rab18无法形成明显的GFP片段条带，而Rab17可以，因此我们排除了Rab17。通过这一轮筛选，我们发现28个RabGTPase蛋白在Atg7缺失时无法被有效酶解。图1.3自噬阻断时GFP酶解实验。使用GFP-Rabs表达质粒，在Atg7-/-HEK293细胞中瞬时表达GFP-Rabs蛋白，24h后对照组使用DMSO处理2h，处理组使用Torin1（50nM）处理2h。自噬诱导后mCherry-GFP-Rab荧光检测相较于mCherry，GFP的荧光信号在溶酶体的酸性环境中更容易淬灭，因此通过构建mCherry-GFP-Rabs质粒在U2OS细胞表达相应蛋白，在荧光显微镜下进行观察。若GFP和mCherry的荧光信号出现重叠（黄色），则代表该蛋白不在溶酶体相关囊泡内；而如果出现单独的mCherry荧光信号（红色），则代表该蛋白在溶酶体相关囊泡内（DanielJ.Klionskyetal.,2007）。如图1.4所示，图中Rab6、Rab8
本文编号：3581392
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