RNA m6A共转录调控组蛋白H3K9me2去甲基化的作用和机制研究
发布时间：2022-02-04 21:37
m6A是mRNA和lncRNA上一种广泛存在的修饰,它从酵母到人等多个物种中都保守存在且其共有基序为RRm6ACH（R=G or A,H=A,C or U）[1-3]。m6A通过其核心甲基化转移酶复合物METTL3-METTL14共转录产生[4-6],并且被去甲基化酶FTO/ALKBH5去除[2,7]。m6A可以被含有YTH结构域的家族蛋白所识别从而调控多种转录后过程。m6A的失调会导致多个关键的生物学过程失衡[8]。越来越多的证据证明了转录这个过程能够调控染色质的动态变化[9,10]。但共转录产生的m6A对染色质的直接调节作用仍然未知。表观基因组的动态变化对于基因在发育和健康生理过程中的正确表达至关重要[11-15]。其中转录是这个过程的核心[10,16-20]。转录整合了染色质结构和修饰变化带来的细胞信号,转录复合物以及mRNA修饰,如共转录发生的m6A修饰。然而动态表观基因组有机整合这几方面信息的作用和机制尚未阐明,基于此,我们对组蛋白修饰与共转录的RNA m6A修饰进行了研究。首先,我们建立了一个筛选组蛋白修饰的报告系统,发现当转录本上发生了m6A修饰时,对应的染色质上抑制型组...
【文章来源】：南方医科大学广东省
【文章页数】：137 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１－５：?ｍ６Ａ代表性的识别蛋白功能结构域示意图ｎ３７］
??ｍ?（Ｃ?一＊?丁?ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）?＾??Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ?ａｔ?６ｍＡ?ｓｉｔｅｓ????Ｉ?Ｐｒｅｐａｒｅ?ｃＤＮＡ?ｌｉｂｒａｒｙ??Ｐｅａｋｓ?ｏｆ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｒｅａｄｓ?Ｉ?Ｓｕｂｊｅｃｔ?ｔｏ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ??ｉｎｄｉｃａｔｅ?ｒｅｇｉｏｎｓ?ｏｆ?６ｍＡ?ｙ??Ｄｅｔｅｃｔ?ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ?６ｍＡ?ｓｉｔｅｓ??ＧＡＣ－?■■■■??￣￣?Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ??ｃ??ＺＩＺ?Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ??图１－６：?ＭｅＲＩＰ和ｍｉＣＬＩＰ的示意图【１３７］??Ａ：?ｍ６Ａ甲基化在全基因组范围内检测方法，ＭｅＲＩＰ和ｍｉＣＬＩＰ方法大致过程的示意图。在??这两种方法中，细胞ＲＮＡ被打断进行片段化并且和识别ｍ６Ａ的抗体孵育。在ＭｅＲ［Ｐ方法??中，甲基化的ＲＮＡ通过抗体－磁珠复合物直接被免疫共沉淀下来，然后这些结合下来的甲基??化的ＲＮＡ被蛋白酶Ｋ消化下来或者通过游离的ｍ６Ａ单体竞争性洗脱下来。洗脱下来的片??段化的ＲＮＡ即可进行高通量测序。测序的ｒｅａｄｓ会在ｍ６Ａ位点附近富集，这样可以对一个??或者多个ｍ６Ａ位点进行预测出大约］００－２００ｎｔ范围的ｍ６Ａ?ｐｅａｋ。５’端的ＲＮＡ富集可能是??ｍ６Ａ，也可能是ｍ６Ａｍ。（ｂ）在ｍｉ－ＣＬＩＰ实验中，在做免疫共沉淀之前，先把ｍ６Ａ抗体和甲??基化的ＲＮＡ交联起来，这样通过蛋白酶Ｋ消化后，甲基化的ＲＮＡ会留下一个小的交联产??物，在后续逆转录反应时会导致甲基化位点附近发生截断或者突变，然后扩增产生的ｃＤＮＡ??进行二代测序，通过检测测序ｒｅａｄｓ中突变和截断位点来判断单个ｍ６Ａ和ｍ６Ａｍ位点。??
?博士学位论文???Ａ??广?—?￣?Ｘ??＾?ｃ〇ｎｔｒａｌ?ＱＢ?ａｔｇ?ｐ〇＂＇?Ｓ／／??｜?＜ｇ?Ｉ?－■?ｊ??１?＾?１３＾?ｍ６Ａ?／／＇ｇｎ?＾ｃ?＾ｃ?＾ｃ?ｍ／／??ｌ?ｗ?￣??Ｊ??，ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ?＃?Ｈ３Ｋ９ｍｅ２?ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ?？Ｏｔｈｅｒ?ｈｉｓｔｏｎｅ?ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ?＾?ｍ６Ａ?＾?ＲＮＡ?—－？■?ＰＣＲ?ｐｒｉｍｅｒ??图３－１：?ｍ６Ａ报告系统和对照报告系统的模式图??Ａ：筛选能相应ｍ６Ａ的表观修饰的报告系统图，含有ｍ６Ａｍｏｔｉｆ（ＧＧＡＣ）和对照序列（ＧＧＴＣ）??的外源质粒定点整合到宿主细胞基因组中。??Ｆｉｇｕｒｅ?３－１：?Ｔｈｅ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｍ６Ａ?ｒｅｐｏｒｔｅｒ?ａｎｄ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｒｅｐｏｒｔｅｒ??Ａ：?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｓｙｓｔｅｍ?ｔｏ?ｍｏｎｉｔｏｒ?ｒｅｓｐｏｎｓｅ?ｔｏ?ｍ６Ａ．?Ｐｌａｓｍｉｄｓ?ｗｉｔｈ?ｅｉｔｈｅｒ??ＧＧＡＣ?（ｍ６Ａ?ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ?ｍｏｔｉｆ）?ｏｒ?ＧＧＴＣ?（ｃｏｎｔｒｏｌ?ｍｏｔｉｆ）?ｗｅｒｅ?ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ?ｉｎｔｏ?Ｆｌｐ－Ｉｎ?ＨＥＫ２９３?ｃｅｌｌｓ．??然后对这两株单克隆细胞进行检测（３－２Ａ，?２Ｂ），证明其插入序列确实在ＦＲＴ??定点插入的位置，而排除随机插入的可能；通过ＤＮＡ凝胶电泳结果可以看出来，??定点阳性引物在两个报告组中都能检测到阳性条带（３－２Ａ），而表达质粒原始引??物在两个报告组中均位阴性，说明没有随机插入（３－２Ｂ）；然后对这两株细胞进??行ｄｏ
【参考文献】：
期刊论文
[1]Recruitment and reinforcement: maintaining epigenetic silencing[J]. Chengzhi Wang,Bing Zhu,Jun Xiong. Science China（Life Sciences）. 2018(05)
本文编号：3613986
【文章来源】：南方医科大学广东省
【文章页数】：137 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１－５：?ｍ６Ａ代表性的识别蛋白功能结构域示意图ｎ３７］
??ｍ?（Ｃ?一＊?丁?ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）?＾??Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ?ａｔ?６ｍＡ?ｓｉｔｅｓ????Ｉ?Ｐｒｅｐａｒｅ?ｃＤＮＡ?ｌｉｂｒａｒｙ??Ｐｅａｋｓ?ｏｆ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｒｅａｄｓ?Ｉ?Ｓｕｂｊｅｃｔ?ｔｏ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ??ｉｎｄｉｃａｔｅ?ｒｅｇｉｏｎｓ?ｏｆ?６ｍＡ?ｙ??Ｄｅｔｅｃｔ?ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ?６ｍＡ?ｓｉｔｅｓ??ＧＡＣ－?■■■■??￣￣?Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ??ｃ??ＺＩＺ?Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ??图１－６：?ＭｅＲＩＰ和ｍｉＣＬＩＰ的示意图【１３７］??Ａ：?ｍ６Ａ甲基化在全基因组范围内检测方法，ＭｅＲＩＰ和ｍｉＣＬＩＰ方法大致过程的示意图。在??这两种方法中，细胞ＲＮＡ被打断进行片段化并且和识别ｍ６Ａ的抗体孵育。在ＭｅＲ［Ｐ方法??中，甲基化的ＲＮＡ通过抗体－磁珠复合物直接被免疫共沉淀下来，然后这些结合下来的甲基??化的ＲＮＡ被蛋白酶Ｋ消化下来或者通过游离的ｍ６Ａ单体竞争性洗脱下来。洗脱下来的片??段化的ＲＮＡ即可进行高通量测序。测序的ｒｅａｄｓ会在ｍ６Ａ位点附近富集，这样可以对一个??或者多个ｍ６Ａ位点进行预测出大约］００－２００ｎｔ范围的ｍ６Ａ?ｐｅａｋ。５’端的ＲＮＡ富集可能是??ｍ６Ａ，也可能是ｍ６Ａｍ。（ｂ）在ｍｉ－ＣＬＩＰ实验中，在做免疫共沉淀之前，先把ｍ６Ａ抗体和甲??基化的ＲＮＡ交联起来，这样通过蛋白酶Ｋ消化后，甲基化的ＲＮＡ会留下一个小的交联产??物，在后续逆转录反应时会导致甲基化位点附近发生截断或者突变，然后扩增产生的ｃＤＮＡ??进行二代测序，通过检测测序ｒｅａｄｓ中突变和截断位点来判断单个ｍ６Ａ和ｍ６Ａｍ位点。??
?博士学位论文???Ａ??广?—?￣?Ｘ??＾?ｃ〇ｎｔｒａｌ?ＱＢ?ａｔｇ?ｐ〇＂＇?Ｓ／／??｜?＜ｇ?Ｉ?－■?ｊ??１?＾?１３＾?ｍ６Ａ?／／＇ｇｎ?＾ｃ?＾ｃ?＾ｃ?ｍ／／??ｌ?ｗ?￣??Ｊ??，ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ?＃?Ｈ３Ｋ９ｍｅ２?ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ?？Ｏｔｈｅｒ?ｈｉｓｔｏｎｅ?ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ?＾?ｍ６Ａ?＾?ＲＮＡ?—－？■?ＰＣＲ?ｐｒｉｍｅｒ??图３－１：?ｍ６Ａ报告系统和对照报告系统的模式图??Ａ：筛选能相应ｍ６Ａ的表观修饰的报告系统图，含有ｍ６Ａｍｏｔｉｆ（ＧＧＡＣ）和对照序列（ＧＧＴＣ）??的外源质粒定点整合到宿主细胞基因组中。??Ｆｉｇｕｒｅ?３－１：?Ｔｈｅ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｍ６Ａ?ｒｅｐｏｒｔｅｒ?ａｎｄ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｒｅｐｏｒｔｅｒ??Ａ：?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｓｙｓｔｅｍ?ｔｏ?ｍｏｎｉｔｏｒ?ｒｅｓｐｏｎｓｅ?ｔｏ?ｍ６Ａ．?Ｐｌａｓｍｉｄｓ?ｗｉｔｈ?ｅｉｔｈｅｒ??ＧＧＡＣ?（ｍ６Ａ?ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ?ｍｏｔｉｆ）?ｏｒ?ＧＧＴＣ?（ｃｏｎｔｒｏｌ?ｍｏｔｉｆ）?ｗｅｒｅ?ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ?ｉｎｔｏ?Ｆｌｐ－Ｉｎ?ＨＥＫ２９３?ｃｅｌｌｓ．??然后对这两株单克隆细胞进行检测（３－２Ａ，?２Ｂ），证明其插入序列确实在ＦＲＴ??定点插入的位置，而排除随机插入的可能；通过ＤＮＡ凝胶电泳结果可以看出来，??定点阳性引物在两个报告组中都能检测到阳性条带（３－２Ａ），而表达质粒原始引??物在两个报告组中均位阴性，说明没有随机插入（３－２Ｂ）；然后对这两株细胞进??行ｄｏ
【参考文献】：
期刊论文
[1]Recruitment and reinforcement: maintaining epigenetic silencing[J]. Chengzhi Wang,Bing Zhu,Jun Xiong. Science China（Life Sciences）. 2018(05)
本文编号：3613986
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3613986.html
教材专著
