CRISPR/Cas9介导家蚕基因组编辑结果的系统分析与机理初探
发布时间：2022-02-11 20:57
自上个世纪七十年代以来,科学家们一直致力于探索基因组的编辑技术。随着1996年的锌指核酸酶（Zinc-Finger Nuclease,ZFN）和2009年的转录激活效应因子核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nuclease,TALEN）相继发现并作为基因编辑手段进行应用,在基因组和基因功能相关研究方面取得了许多重要发现和进展。而在2013年,成簇的、规律间隔的短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated 9,CRISPR/Cas9）技术的出现,开启了基因组编辑技术研究新的阶段。CRISPR/Cas9及其衍生物作为当今研究最火热的编辑手段,其突变效率高,易于操作的特点使其目被广泛用于应用于多个模式生物的基因功能研究和目标疾病治疗中,为生命科学的发展带来了革命性的变化。然而,目前对Cas9编辑结果的理解尚存在许多未解谜题。目前普遍认为CRISPR/Cas9编辑后,会在打靶位点产生随机碱基插入或缺失（indel）,除人为引入...
【文章来源】：西南大学重庆市211工程院校教育部直属院校
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR-Cas和基因组工程研究领域的时间轴[4]
妒垦?宦畚?2早期的基因组编辑方法都依赖于DNA序列的位点特异性识别，包括利用靶向DNA切割方法识别寡核苷酸的DNA碱基；利用寡核苷酸与化学裂解或交联试剂偶联对酵母和哺乳动物细胞的位点特异性染色体的修饰[5–7]；肽核酸(PNAs)和聚酰胺使染色体位点发生靶向的结合[8,9]等。虽然这些方法并没有达到高效稳定的编辑，但它们证明了多种化学物质在位点特异性基因组修饰中的效用，使得特定位点的DNA可被切割。随后，基因编辑技术飞速发展，多种编辑方式陆续出现，包括ZFNs[10–12]、TALENs[13–15]和CRISPR/Cas9[16–18]（图1.2）等。图1.2可编程序列特异性基因组编辑核酸酶的比较[19]Fig1.2Comparisonofprogrammablesequence-specific1.1.1ZFN编辑技术概述重复锌结合域最早在非洲爪蟾（Xenopuslaevis）卵母细胞的转录因子IIIA中发现并鉴定，研究人员确定了一个X3-Cys-X2-4-Cys-X12-His-X3-4-His-X4的序列基序(其中X可以是任何氨基酸)，并被命名为锌指结构域[20]。少数含有锌指结构域的蛋白质被详细研究并发现这些锌指结构域存在于许多调节真核生物基因表达的蛋白质中，能够与DNA结合并参与真核生物基因调控[21,22]。为了了解这些锌指结构域在位点特异性识别中的作用，Pavletich和Pabo表达、纯化并解析了锌指结构域，并讨论了锌指结构与DNA的相互作用以及蛋白质与DNA识别的意义，考虑了使用锌指结构域作为设计新的DNA结合蛋白基础的前景[11]。通过两个不同的锌指蛋白与FokI核酸内切酶的切割域连接，创造出了新的位点特异性核酸内切酶。当两种融合蛋白处于最佳活性条件下，可以以序列特异性的方式切割DNA[23]。因此，将锌指结构域中的锌指基序和FokI内切酶的模块结构结合，使得创建可以在靶向位点附近切割DNA死亡“人造”核酸酶成为可能
第一章文献综述5胞无法对DNA损伤做出恰当的反应或修复，则会导致基因组不稳定，进而可能提高癌症的发病率。目前发现的细胞内源性修复途径主要由单链断裂修复（singlestrandbreakrepair,SSBR）和双链断裂修复（doublestrandbreakrepair,DSBR）两种。1.2.1单链断裂修复修复DNA损伤的遗传缺陷涉及多种疾病，其中许多疾病的典型表现是神经功能障碍、遗传不稳定性和癌症的增加。在细胞中出现的不同类型的DNA损伤中，单链断裂(singlestrandbreak,SSB)是最常见的，由细胞内代谢物的直接攻击和自发的DNA衰变造成，每个细胞每天发生着数以万计的损伤[44]。图1.3全局单链断裂修复模型[44]Fig1.3Modelforglobalsingle-strandbreakrepairSSB是指DNA双螺旋结构中的一条链出现不连续性，通常伴有单个核苷酸的缺失，或者在断裂部位的5’、3’端受损（图1.3）。SSBs最常见的来源之一是内源性活性氧(ROS)的氧化
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展[J]. 李聪,曹文广. 生物工程学报. 2015(11)
[2]DNA双链断裂与NHEJ修复的研究进展[J]. 董隽,张天,文碧秀. 中华放射肿瘤学杂志. 2014 (06)
[3]类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）介导的基因组定点修饰技术[J]. 沈延,肖安,黄鹏,王唯晔,朱作言,张博. 遗传. 2013(04)
[4]NHEJ途径修复DSB的研究进展[J]. 孟荣荣,应明真,王雅杰. 医学研究杂志. 2013(01)
本文编号：3620937
【文章来源】：西南大学重庆市211工程院校教育部直属院校
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR-Cas和基因组工程研究领域的时间轴[4]
妒垦?宦畚?2早期的基因组编辑方法都依赖于DNA序列的位点特异性识别，包括利用靶向DNA切割方法识别寡核苷酸的DNA碱基；利用寡核苷酸与化学裂解或交联试剂偶联对酵母和哺乳动物细胞的位点特异性染色体的修饰[5–7]；肽核酸(PNAs)和聚酰胺使染色体位点发生靶向的结合[8,9]等。虽然这些方法并没有达到高效稳定的编辑，但它们证明了多种化学物质在位点特异性基因组修饰中的效用，使得特定位点的DNA可被切割。随后，基因编辑技术飞速发展，多种编辑方式陆续出现，包括ZFNs[10–12]、TALENs[13–15]和CRISPR/Cas9[16–18]（图1.2）等。图1.2可编程序列特异性基因组编辑核酸酶的比较[19]Fig1.2Comparisonofprogrammablesequence-specific1.1.1ZFN编辑技术概述重复锌结合域最早在非洲爪蟾（Xenopuslaevis）卵母细胞的转录因子IIIA中发现并鉴定，研究人员确定了一个X3-Cys-X2-4-Cys-X12-His-X3-4-His-X4的序列基序(其中X可以是任何氨基酸)，并被命名为锌指结构域[20]。少数含有锌指结构域的蛋白质被详细研究并发现这些锌指结构域存在于许多调节真核生物基因表达的蛋白质中，能够与DNA结合并参与真核生物基因调控[21,22]。为了了解这些锌指结构域在位点特异性识别中的作用，Pavletich和Pabo表达、纯化并解析了锌指结构域，并讨论了锌指结构与DNA的相互作用以及蛋白质与DNA识别的意义，考虑了使用锌指结构域作为设计新的DNA结合蛋白基础的前景[11]。通过两个不同的锌指蛋白与FokI核酸内切酶的切割域连接，创造出了新的位点特异性核酸内切酶。当两种融合蛋白处于最佳活性条件下，可以以序列特异性的方式切割DNA[23]。因此，将锌指结构域中的锌指基序和FokI内切酶的模块结构结合，使得创建可以在靶向位点附近切割DNA死亡“人造”核酸酶成为可能
第一章文献综述5胞无法对DNA损伤做出恰当的反应或修复，则会导致基因组不稳定，进而可能提高癌症的发病率。目前发现的细胞内源性修复途径主要由单链断裂修复（singlestrandbreakrepair,SSBR）和双链断裂修复（doublestrandbreakrepair,DSBR）两种。1.2.1单链断裂修复修复DNA损伤的遗传缺陷涉及多种疾病，其中许多疾病的典型表现是神经功能障碍、遗传不稳定性和癌症的增加。在细胞中出现的不同类型的DNA损伤中，单链断裂(singlestrandbreak,SSB)是最常见的，由细胞内代谢物的直接攻击和自发的DNA衰变造成，每个细胞每天发生着数以万计的损伤[44]。图1.3全局单链断裂修复模型[44]Fig1.3Modelforglobalsingle-strandbreakrepairSSB是指DNA双螺旋结构中的一条链出现不连续性，通常伴有单个核苷酸的缺失，或者在断裂部位的5’、3’端受损（图1.3）。SSBs最常见的来源之一是内源性活性氧(ROS)的氧化
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展[J]. 李聪,曹文广. 生物工程学报. 2015(11)
[2]DNA双链断裂与NHEJ修复的研究进展[J]. 董隽,张天,文碧秀. 中华放射肿瘤学杂志. 2014 (06)
[3]类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）介导的基因组定点修饰技术[J]. 沈延,肖安,黄鹏,王唯晔,朱作言,张博. 遗传. 2013(04)
[4]NHEJ途径修复DSB的研究进展[J]. 孟荣荣,应明真,王雅杰. 医学研究杂志. 2013(01)
本文编号：3620937
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