谷氨酸棒杆菌内源表达元件5’UTR强度的鉴定与应用

发布时间：2022-02-14 21:10

　　谷氨酸棒杆菌拥有无内毒素、易实现目标蛋白胞外分泌、胞外水解酶活性较低以及内源蛋白几乎不分泌等特点,是较为理想的外源蛋白表达宿主。但目前在谷氨酸棒杆菌中可利用的蛋白表达载体相对较少,开发新型高效表达载体对谷氨酸棒杆菌的工业应用具有重要意义。本课题针对这些问题,做了如下研究。通过鉴定谷氨酸棒杆菌高表达基因5’UTR及其下游序列并将其分别构建单、双顺反子表达组件,初步筛选了多个高强度的表达载体。首先,根据文献报道,在谷氨酸棒杆菌中依据内源蛋白表达丰度的高低我们筛选了 12个基因,并通过5’RACE实验成功鉴定了这12个基因的5’UTR及其下游序列,其中9个基因具有5’UTR序列,而另外3个基因则缺少5’UTR序列。将不同的5’UTR序列与组成型启动子PH36组合成新的单顺反子表达组件 pH36-UTR,以增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）作为报告蛋白,发现5’UTR能够显著影响着PH36启动子的转录活性以及蛋白的翻译效率。随后将5’UTR及其下游62 bp序列与启动子PH36组成双顺反子表达组件pH36-BUTR,与单顺反子相... 

【文章来源】：江南大学江苏省211工程院校教育部直属院校

【文章页数】：50 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

功能性基因表达组件包含了启动子和5"UTR序列

江南大学硕士学位论文8图1-2原核生物中多顺反子基因表达调控策略Fig.1-2PolycistronicgeneexpressioninProkaryotes1.3.2双顺反子策略在谷氨酸棒杆菌中表达载体开发的应用研究发现，在谷氨酸棒杆菌中的双顺反子表达模型比单顺反子表达模型能够显著提高外源蛋白的表达能力[41]。如图1-3所示，启动子与基因5"UTR组成单顺反子表达模型，启动子与基因5"UTR及其下游62bp和保守SD序列（AAAGGAGGACAACTAATG）组成双顺反子表达模型，核糖体启动前顺反子翻译后，直接起始下游mRNA的翻译，使得核糖体能够在SD2区聚集，极大地增加后一个基因mRNA的翻译效率，从而提高了外源蛋白的表达水平。图1-3谷氨酸棒杆菌中双顺反子表达组件Fig.1-3bicistronicexpressionmodelinC.glutamicum1.4谷氨酸棒杆菌分泌表达外源蛋白谷氨酸棒杆菌展现了优异的外源蛋白表达能力，受到了越来越多研究者的重视，近些年已经成功地在谷氨酸棒杆菌中实现了多种异源蛋白的高效表达，例如Liu等人利用谷氨酸棒杆菌分泌表达淀粉酶，产量达到103.5mgL-1；Yim等人通过谷氨酸棒杆菌成功实现单链抗体（singlechainantibodyfragment,scFv）的高效表达。

江南大学硕士学位论文8图1-2原核生物中多顺反子基因表达调控策略Fig.1-2PolycistronicgeneexpressioninProkaryotes1.3.2双顺反子策略在谷氨酸棒杆菌中表达载体开发的应用研究发现，在谷氨酸棒杆菌中的双顺反子表达模型比单顺反子表达模型能够显著提高外源蛋白的表达能力[41]。如图1-3所示，启动子与基因5"UTR组成单顺反子表达模型，启动子与基因5"UTR及其下游62bp和保守SD序列（AAAGGAGGACAACTAATG）组成双顺反子表达模型，核糖体启动前顺反子翻译后，直接起始下游mRNA的翻译，使得核糖体能够在SD2区聚集，极大地增加后一个基因mRNA的翻译效率，从而提高了外源蛋白的表达水平。图1-3谷氨酸棒杆菌中双顺反子表达组件Fig.1-3bicistronicexpressionmodelinC.glutamicum1.4谷氨酸棒杆菌分泌表达外源蛋白谷氨酸棒杆菌展现了优异的外源蛋白表达能力，受到了越来越多研究者的重视，近些年已经成功地在谷氨酸棒杆菌中实现了多种异源蛋白的高效表达，例如Liu等人利用谷氨酸棒杆菌分泌表达淀粉酶，产量达到103.5mgL-1；Yim等人通过谷氨酸棒杆菌成功实现单链抗体（singlechainantibodyfragment,scFv）的高效表达。


本文编号：3625277