HeLa细胞核抽出物中一种新的具有H2A.Z置换活性组分的纯化和鉴定
发布时间：2022-02-19 14:59
在真核细胞中,遗传信息储存在DNA中并且以核小体为基本单位装载在染色质中。H2A.Z是存在于酵母和人细胞中的H2A一个高度保守的变体,它在染色质中的存在被认为与基因转录调控、DNA损伤修复、基因组稳定性相关。将组蛋白变体置换进、出染色质是染色质重塑中非常重要的组成部分。已经有很多发表的论文中报导了一些具有H2A.Z置换功能的酶。酵母中Swr1和它在人细胞中的两个同源物SRCAP和P400/TIP60是已经比较清楚的被证实的具有活性的染色质重塑酶。最近的研究表明,H2A..Z可以被TIP60置换进DSB（DNA双链断裂）位点,而不依赖于TIP60的乙酰基转移酶活性。H2A.Z缺失会导致非同源末端连接（NHEJ）复合物KU70/KU80无法募集到DSB部位,使DSB的修复过程无法继续。H2A.Z被置换进核小体是发挥了基因转录激活亦或抑制作用还不十分清楚,但是H2A.Z在promoter区临近核小体的存在会导致DNA对于RNA聚合酶可接近性的改变,从而能影响基因转录。另外,H2A.Z在DSB损伤修复中也起着非常重要的作用。为了筛选其它并没有被发现可能具有H2A.Z置换功能的蛋白组分,我们将1...
【文章来源】：吉林大学吉林省211工程院校985工程院校教育部直属院校
【文章页数】：93 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
1.1 表观遗传学的概念
1.2 表观遗传学的分子机制
1.2.1 DNA甲基化
1.2.2 组蛋白修饰
1.2.3 染色质重塑
1.2.4 RNA干扰
1.3 染色质重塑复合物
1.3.1 染色质重塑的概念
1.3.2 重塑复合物的分类和作用机制
1.3.3 组蛋白变体的置换
1.4 DNA-PKcs蛋白的结构和功能
1.4.1 DNA-PKcs的结构
1.4.2 DNAPK complex在DNA修复中的作用
1.4.3 DNA-PKcs在癌症发生发展中的作用
1.4.4 DNA-PKcs在P53介导的细胞凋亡中的作用
第2章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验仪器
2.1.2 实验试剂
2.1.3 实验抗体
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养及处理
2.2.2 质粒瞬时转染
2.2.4 免疫荧光染色实验
2.2.5 体外重组核小体
2.2.6 体外核小体置换实验
2.2.7 染色质抽提实验
2.2.9 慢病毒包装与感染
第3章 实验过程与结果讨论
3.1 体外核小体置换实验模型的建立与验证
3.1.1 引言
3.1.2 体外重组核小体
3.1.3 体外组蛋白置换模型的有效性验证
3.1.4 小结
3.2 HeLa细胞核抽出物中含有DNA-PK-cs和 condensin complexII的蛋白组分具有体外置换组蛋白的能力
3.2.1 引言
3.2.2 HeLa细胞中蛋白组分的分离及H2A.Z置换功能鉴定
3.2.3 对活性组分H2A.Z置换活性的进一步验证
3.2.4 活性组分中蛋白成分的鉴定
3.2.5 不同步骤的纯化方法锁定具有活性的蛋白
3.2.6 小结
3.3 DNA-PKcs和Condensin complexII在细胞内的相互作用
3.3.1 引言
3.3.2 对活性组分进一步的分离
3.3.3 内源蛋白的免疫共沉淀实验
3.3.4 稳转细胞系中二者的免疫共沉淀实验
3.3.5 损伤模型中DNA-PKcs和 condensin complexII的定位
3.3.6 小结
3.4 纯化的DNA-PKcs和 condensin complexII是否具有体外置换组蛋白的能力
3.4.1 引言
3.4.2 nCAPH2蛋白对H2A.Z的置换活性很弱。
3.4.3 DNA-PKcs蛋白在体外具有H2A.Z置换活性
3.4.4 DNA-PKcs通过激酶活性发挥H2A.Z置换功能
3.4.5 DNA-PKcs对 H2A.Z的置换是否具有特异性
3.4.6 小结
3.5 DNA损伤模型中DNA-PKc对 H2A.Z募集情况的影响
3.5.1 引言
3.5.2 在X射线损伤模型中敲低DNA-PKcs对 H2A.Z募集的影响。
3.5.3 在ASI-U2OS细胞系中敲低DNA-PKcs对 H2A.Z募集的影响
3.5.4 小结
第4章 讨论
参考文献
作者简介及攻读博士学位期间发表的学术成果
致谢
本文编号：3633113
【文章来源】：吉林大学吉林省211工程院校985工程院校教育部直属院校
【文章页数】：93 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
1.1 表观遗传学的概念
1.2 表观遗传学的分子机制
1.2.1 DNA甲基化
1.2.2 组蛋白修饰
1.2.3 染色质重塑
1.2.4 RNA干扰
1.3 染色质重塑复合物
1.3.1 染色质重塑的概念
1.3.2 重塑复合物的分类和作用机制
1.3.3 组蛋白变体的置换
1.4 DNA-PKcs蛋白的结构和功能
1.4.1 DNA-PKcs的结构
1.4.2 DNAPK complex在DNA修复中的作用
1.4.3 DNA-PKcs在癌症发生发展中的作用
1.4.4 DNA-PKcs在P53介导的细胞凋亡中的作用
第2章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验仪器
2.1.2 实验试剂
2.1.3 实验抗体
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养及处理
2.2.2 质粒瞬时转染
2.2.4 免疫荧光染色实验
2.2.5 体外重组核小体
2.2.6 体外核小体置换实验
2.2.7 染色质抽提实验
2.2.9 慢病毒包装与感染
第3章 实验过程与结果讨论
3.1 体外核小体置换实验模型的建立与验证
3.1.1 引言
3.1.2 体外重组核小体
3.1.3 体外组蛋白置换模型的有效性验证
3.1.4 小结
3.2 HeLa细胞核抽出物中含有DNA-PK-cs和 condensin complexII的蛋白组分具有体外置换组蛋白的能力
3.2.1 引言
3.2.2 HeLa细胞中蛋白组分的分离及H2A.Z置换功能鉴定
3.2.3 对活性组分H2A.Z置换活性的进一步验证
3.2.4 活性组分中蛋白成分的鉴定
3.2.5 不同步骤的纯化方法锁定具有活性的蛋白
3.2.6 小结
3.3 DNA-PKcs和Condensin complexII在细胞内的相互作用
3.3.1 引言
3.3.2 对活性组分进一步的分离
3.3.3 内源蛋白的免疫共沉淀实验
3.3.4 稳转细胞系中二者的免疫共沉淀实验
3.3.5 损伤模型中DNA-PKcs和 condensin complexII的定位
3.3.6 小结
3.4 纯化的DNA-PKcs和 condensin complexII是否具有体外置换组蛋白的能力
3.4.1 引言
3.4.2 nCAPH2蛋白对H2A.Z的置换活性很弱。
3.4.3 DNA-PKcs蛋白在体外具有H2A.Z置换活性
3.4.4 DNA-PKcs通过激酶活性发挥H2A.Z置换功能
3.4.5 DNA-PKcs对 H2A.Z的置换是否具有特异性
3.4.6 小结
3.5 DNA损伤模型中DNA-PKc对 H2A.Z募集情况的影响
3.5.1 引言
3.5.2 在X射线损伤模型中敲低DNA-PKcs对 H2A.Z募集的影响。
3.5.3 在ASI-U2OS细胞系中敲低DNA-PKcs对 H2A.Z募集的影响
3.5.4 小结
第4章 讨论
参考文献
作者简介及攻读博士学位期间发表的学术成果
致谢
本文编号：3633113
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3633113.html
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